葡萄酒中14种单体酚的高效液相色谱测定_韩国民

1802011,Vol.32,No.02食品科学※分析检测葡萄酒中14种单体酚的高效液相色谱测定韩国民1，陈锋1，侯敏1，王华1,2,*(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程研究技术中心，陕西杨凌712100)摘要：建立一种新的、同时测定葡萄酒中14种单体酚含量的高效液相色谱法。采用ZORBAXSB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，乙腈-冰醋酸-水溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。测定6种不同地区、不同年份的赤霞珠干红葡萄酒中14种单体酚的含量。结果表明，不同地区相同品种葡萄酒中没食子酸、儿茶素、表儿茶素3种单体酚含量均较高，但14种单体酚含量各不相同，同地区不同年份的赤霞珠葡萄酒单体酚含量亦有差别，葡萄酒中几种主要单体酚随时间的变化含量均有降低，同时伴随着部分单体酚含量的增加。关键词：高效液相色谱；葡萄酒；单体酚Determinationof14Mono-phenolsinDryRedWinesbyHPLCHANGuo-min1，CHENFeng1，HOUMin1，WANGHua1,2,*(1.CollegeofEnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling2.ShaanxiEngineeringResearchCenterforViti-Viniculture,Yangling712100,China；712100,China)Abstract：Thecontentsof14mono-phenolsinsixCabernetSauvignondryredwineswithdifferentagingtimesordifferentgeographicaloriginsofgrapeweredeterminedusingaHPLCmethod.ThechromatographicseparationwasperformedonaZORBAXSB-C18columnat30℃withanacetonitrile/aceticacid/watermixtureasamobilephaseataflowrateof1.0mL/minandthedetectionwavelengthwassetat280nm.Thecontentsof14mono-phenolsinCabernetSauvignonwinevariedwithgeographicaloriginofgrape,andhighercontentsofgallicacid,catechin,andepicatechinwerefoundinallthesixwinesamples.CabernetSauvignonwineswithdifferentagingtimesfromthesameregiondifferedintheirmono-phenolscontentaswell.Thecontentsofseveralmajormono-phenolsdecreasedwithincreasingagingtime,whileafewothersexhibitedanoppositechange.Keywords：HPLC；wine；mono-phenols；agingtime；origin中图分类号：TS201.2文献标识码：A文章编号：1002-6630(2011)02-0180-04葡萄酒含有丰富的酚类化合物，主要有非类黄酮和类黄酮两大类，非类黄酮主要包括酚酸类化合物，类黄酮主要有花色苷类、黄酮醇类、黄烷酮醇类、黄烷醇类、原花色素、水解性单宁等[1]。酚类物质对葡萄果实的色泽、风味以及葡萄酒的口感、营养价值都具有重要的作用[2]。国内外研究表明，酚类物质主要来自葡萄果梗、果皮和果粒等，其结构和含量在发酵过程中和葡萄酒陈酿阶段都会有很大的变化[3]。多酚物质决定葡萄酒的外观、滋味、收敛性、口感及微生物稳定性[4-10]，这些指标被广泛应用作为评价葡萄果件[13-14]、栽培技术、土壤耕作[12,15-16]、成熟度[17]等不同而有所差异。酚类物质大多以结合态和聚合度不同的聚合态形式存在，且含量多少不一，要准确分析所有酚类物质很难[18]。成宇峰等[19]通过对流动相等色谱条件的优选选择，分离出了没食子酸等10种单体酚化合物，陈建业等[20]分离出了11种酚酸。葡萄酒的历史悠久，营养丰富，含有酚类等大量生理活性物质，其中单体酚种类较多，且含量不一，因此建立葡萄酒中酚酸类物质的测定方法，分析葡萄酒中各酚酸含量具有重要意义。本实、发酵葡萄汁和葡萄酒质量的参数[11]。葡萄与葡萄实验旨在建立一种新型、能够同时测定葡萄酒中14种单酒中的多酚含量随葡萄品种[12]、原产地气候、土壤条体酚的高效液相色谱分析方法。收稿日期：2010-03-15基金项目：2008年陕西省科技计划项目(2008XH4-2)作者简介：韩国民(1986—)，男，硕士研究生，主要从事葡萄酒化学研究。E-mail：[e-mail]*通信作者：王华(1959—)，女，教授，博士，主要从事葡萄与葡萄酒研究。E-mail：[e-mail]※分析检测食品科学2011,Vol.32,No.0218111.1材料与方法材料与试剂22.1结果与分析检测波长的选择6种不同国产葡萄酒：云南香格里拉干红(2008)(1#)、四川九寨沟干红(2008)(2#)、宁夏贺兰山干红(2008)(3#)、新疆新天干红(2009)(4#)、新疆新天干红(2008)(5#)、新疆新天干红(2007)(6#)，均取自各葡萄酒公司生产车间，葡萄品种均为赤霞珠。用紫外分光光度计对没食子酸、儿茶素等14种单体酚标准样品溶液在波长200～400nm区间内扫描。14种单体酚紫外吸收光谱图显示，其组分最大吸收峰均在280nm处有最大或者较大吸收峰，故选择280nm为检测波长。乙腈、甲醇(均为色谱纯)上海科密欧公司；其余2.2流动相条件的确定试剂为分析纯；实验用水为超纯水；水杨酸(salicylic根据成宇峰等[19]的研究，本实验选取流动相A：acid)、儿茶素(catechin)、香草酸(vanillicacid)美国水-冰醋酸(98:2，V/V)，流动相B：乙腈，为流动相Fluka公司；没食子酸(gallicacid)、咖啡酸(caffeicacid)、香豆酸(p-coumaricacid)、丁香酸(syringicacid)、安息香酸(3,4-dihydroxybenzoicacid)、桑色素(morin)、芦丁(rutin)、反式白藜芦醇(trans-resveratrol)、表儿茶素(-epicatechin)、槲皮素(quercetin)、香豆素(coumarn)美国Sigma公司。1.2仪器与设备SHIMADZU-LC-2010分析型高效液相色谱仪(含UV系统，根据试凑试验法[22]，本实验共设计了90个不同的梯度洗脱程序，其中有代表性的两个梯度条件如下：Ⅰ：0～20min，B为3%～8%；20～30min，B为8%～15%；35～50min，B为15%～30%；50～65min，B为30%～30%；65～75min，B为30%～0%。Ⅱ：0～20min，B为3%～5%；20～35min，B为5%～15%；35～50min，B为15%～30%；50～65min，B为30%～30%；65～75min，B为30%～0%。detector紫外检测器、自动进样器、CLASS-VP工作站)18日本岛津公司；AP-9901S真空过滤器、AS3120B超声波脱气机Autoscience公司；纯水机英国Millipore公司；薄膜旋转蒸发仪上海申生科技有限公司；SHB-111真空泵郑州长城科工贸有限公司。235467910111213141.3方法102030405060701.3.1样品预处理时间/min参考成宇峰等[21]的方法稍加修改。取30mL葡萄酒样，用30mL乙酸乙酯萃取3次，有机相用薄膜旋转蒸发仪(＜40℃)浓缩至干后，残渣溶于3mL色谱甲醇中，置于－20℃避光保存，待液相分析用。测定样品前经0.45μm微孔滤膜过滤。1.没食子酸；2.安息香酸；3.儿茶素；4.香草酸；5.咖啡酸；6.丁香酸；7.表儿茶素；8.香豆酸；9.芦丁；10.水杨酸；11.香豆素；12.白藜芦醇；13.桑色素；14.槲皮素。图1采用梯度条件Ⅰ条件下14种单体酚标准色谱图Fig.1Chromatogramof14mono-phenolstandardsunderthefirstgradientprogram1.3.2色谱条件由图1可知，采用梯度条件Ⅰ时，香草酸和咖啡AgilentZORBAXSB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，紫外检测波长为280nm，柱温30℃，进样量10μL，以峰面积外标法定量。梯度洗脱：流动相A：水-冰醋酸(98:2，V/V)，流动相B：乙腈，流速为1mL/min。洗脱程序：0～20min，B为3%～5%；20～35min，酸两种单体酚不能较好的分离，梯度条件Ⅱ中，降低0～20min乙腈体积分数，延长第二梯度洗脱时间，在不影响其他单体酚分离程度的前提下，香草酸和咖啡酸得到了较好的分离(图2)。由此，选取梯度条件Ⅱ为洗脱条件，该条件有利于14种单体酚的精确测定。B为5%～15%；35～50min，B为15%～30%；50～65min，B为30%～30%；65～75min，B为30%～0%。18a1.3.3标准溶液的配制分别称取没食子酸等14种单体酚9～11mg移至10mL棕色容量瓶中，色谱甲醇定容，封口，作为混合标准母液，将此标准液稀释成不同浓度梯度的标准溶液，2103542067309104011501260131470－30℃保存备用。时间/min1822011,Vol.32,No.02食品科学※分析检测13b相对标准偏差较低(3%以内)。结果表明，乙酸乙酯可用于高效萃取葡萄酒种单体酚，方法精密度高，符合HPLC测定要求。24567891011121314表214种单体酚精密度和加标回收率实验结果(n=6)10203040506070Table2Precisionandrecoverytestsfor14pheolicacids(n=6)时间/min单体酚样品含量/(mg/L)添加量/(mg/L)测定量/(mg/L)相对标准偏差/%回收率/%没食子酸45.45089.61.8793.921.没食子酸；2.安息香酸；3.儿茶素；4.香草酸；5.咖啡酸；6.丁香酸；7.表儿茶素；8.香豆酸；9.芦丁；10.水杨酸；11.香豆素12.白藜芦醇；13.桑色素14.槲皮素。图2采用流动相Ⅱ条件下14种单体酚标准样品(a)和葡萄酒样品(b)的色谱图Fig.2Chromatogramof14mono-phenolstandards(a)andwinesamples(b)underthesecondgradientprogram安息香酸儿茶素香草酸咖啡酸丁香酸表儿茶素香豆酸芦丁水杨酸3.829.85.412.94.923.48.54.910.452.648.851.550.450.6554.251.15050.348.572.9952.358.1252.0369.3751.9350.0455.380.671.230.540.662.830.951.080.971.2585.9992.8691.9191.8293.6689.3987.1391.1591.242.3标准曲线的制备分别配制10～360mg/L6个不同质量浓度的14种单香豆素白藜芦醇桑色素2.254.350.651.1550.550.6948.3551.012.380.892.979686.1193.08体酚混合标准溶液，进样10μL，按上述确定的色谱条槲皮素10.25051.351.7