虾过敏原蛋白纯化中硫酸按沉淀法的改进

1虾过敏原蛋白纯化中硫酸按沉淀法的改进张轶群1，林洪*1，李振兴1，吕朋2(1.中国海洋大学食品学院水产品安全性实验室，山东青岛266003；2.山东出入境检验检疫局，山东青岛266001)摘要：目的优化虾过敏原蛋白纯化的硫酸钱沉淀工艺，提高纯化效果。方法测定不同饱和度硫酸钱溶液的体积和pH，将过敏原蛋白粉末加入固定饱和度和pH的硫酸钱溶液中沉淀，并用SDS-PAGE方法检测不同硫酸氨浓度下蛋白质组分的变化。结果PH7.5的30%饱和度硫酸氨溶液可有效地分离虾过敏原蛋白，进一步柱层析得到只有一条电泳带的样品。结论通过改进硫酸氨沉淀工艺，可提高虾过敏原蛋白的纯化效果。关键词:虾;过敏原;纯化;硫酸氨沉淀中图分类号:8985.2文献标识码:A文章编号:1672-979x(2008)11-0050-03ImprovementofShrimp(Penaeusvannamei)AllergensPurificationbyAmmoniumSulfatePrecipitationZHANGYi-qun1,LINHong*1,LIZhen-xing1,LVPeng2(1.SeafoodSafetyLab,CollegeofFoodScienceandTechnology,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China;2.ShandongEntryExitInspectionAndQuarantineBureau,Qingdao266001,China)Abstract:ObjectiveTooptimizethepurificationtechnologyofshrimpallergensbyammoniumsulfateprecipitationandenhancethepurificationefficiency.MethodsThevolumeandpHvalueofammoniumsulfatesolutionswithdifferentsaturationweremeasured.ThechangesofproteincompositionsindifferentsolutionsweredeterminedbySDS-PAGEafteraddingtheproteinallergenspowdertoammoniumsulfatesolutionswithdifferentpHvalueandconcentration.Results30%saturationammoniumsulfatesolutionwithpH7.5coulddepositshrimpallergenseffectively.Byafurthergelfiltration,theshrimpallergenscouldbeobtainedwithonlyoneelectrophoresisbandConclusionThepurificationefficiencyofshrimpallergenscanbeenhancedbyimprovingtheprecipitationtechnologyofammoniumsulfate.Keywords:shrimp;allergen;purification;ammoniumsulfateprecipitation近年，过敏疾病正成为一种常见、多发病。流行病学研究显示[1]，约33%的过敏反应由食物诱发，有时甚至造成过敏性休克，严重时可危及生命[2-4]。1999年国际食品法典委员会公布的常见致敏食品清单中，虾类及其制品是主要的过敏食物之一[5]。过敏原J哇质的研究、生物体内化学变化过程的实验室再现以及多种抗体的制备，要求纯度较高的过敏原。获得纯化、单一过敏原组分对研究加工方式对过敏原活性的影响，开发能降低海产品过敏原的食品加工技术具有重要的意义。纯化过敏原还可在临床上明确过敏原类型，提高过敏症诊断的灵敏度。研究表明，虾过敏原是一种相对分子质量约36X103的酸性糖蛋白，属肌肉中的原肌球蛋白困。传统的纯化方法主要是用60%饱和度硫酸氨沉淀，再经过凝胶柱层析、离子交换层2析等一系列纯化步骤，方法繁琐。本课题组在研究中改进了传统的方法，获得了较好的结果，提高了纯化率。现以南美白对虾为例，介绍改进后的虾过敏原纯化法，为进一步研究虾过敏原的性质提供物质基础。1材料与仪器1.1材料南美白对虾(Penaeusvannamei，购自青岛南山水产品市场，鲜活品)；优级纯硫酸氨(天津科密欧化学试剂开发中心)；三经甲基氨基甲烷(Tris，生化试剂，青岛福林生物化学公司)；十二烷基硫酸钠（SDS，生化试剂，山东爱博科技贸易公司）。其余试剂为分析纯。1.2仪器DYY一7C型电泳仪(北京六一仪器厂)；Tanon-3500R型凝胶成像及分析系统(上海天能科技公司)；FD1型冷冻干燥机(丹麦Heto公司)；PHS-3C型pH计(上海伟业仪器厂)；BR4i型冷冻离心机(法国Jouan公司)；TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用公司)。2方法2.1虾过敏原提取物的制备参照文献[7]的方法制作含虾肉的丙酮粉。取5g丙酮粉，加入1mol/LKCl40mL，4℃条件下提取24h,，9000r/min离心15min。取上清，将沉淀物在1mol/LKCl溶液20mL中重新溶解，4℃条件下提取4h，然后10000r/min离心15min。取上清，混合2次上清液，沸水浴加热。5000r/min离心后，弃上清，用0.01mol/L.、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析72h，每12h换1次透析液。然后冷冻干燥提取物，置-20℃冰箱备用。2.2不同饱和度硫酸按溶液的体积及pH变化以原始体积为50mL，10%为单位分别配制不同饱和度(20%~90%)的硫酸氨溶液，测定配制前后溶液的体积及pH变化。2.3虾过敏原的硫酸按沉淀以10%为单位，分别配制不同饱和度(30%~60%)的硫酸氨溶液，调pH至7.5，然后分别取20mL，将冻干后的虾过敏原提取物分别加入不同浓度的硫酸氨溶液中至浓度为5mg/mL，0℃条件下搅拌30min，充分沉淀后，4℃条件下10000r/min离心30min。将上清和沉淀分别转移至透析袋中，于双蒸水中透析24h，-20℃冷冻备用。2.4虾过敏原的柱层析纯化硫酸氨沉淀经透析后的溶液在SephadexVG-100凝胶柱上进一步分离。缓冲液为0.05mol/LTris-HCl（pH7.5）)，流速0.5mL/min，收集主峰。2.5SDS-PAGE及凝胶扫描分析用Laemmli建立的不连续电泳体系[8]，其中分离胶浓度为12%(W/V)，堆积胶浓度为5%(W/V)。蛋白质样品稀释为1mg/mL并经样品缓冲液处理，加样量15uL。电泳完毕，考马斯亮蓝R250染色，用GIS凝胶成像系统拍照、分析。2.6蛋白质含量测定用Lowry法测定蛋白质含量[9]。3结果与讨论3.1不同饱和度硫酸按溶液的体积及pH变化分析硫酸氨沉淀广泛用于蛋白质纯化，是一种有效的分离方法。传统方法是在一定浓度的蛋白质溶液中加入固体硫酸氨或饱和硫酸氨溶液，使溶液pH值降低到某些弱酸性蛋白质的等电点而沉淀，导致沉淀中杂蛋白增多。本研究比较了不同饱和度条件下溶液体积和pH的变3化，为建立准确的硫酸按沉淀条件提供基础数据。由表1可见，在50mL双蒸水中加入硫酸氨后，溶液体积随饱和度增高逐渐增大，由50mL增至69.12mL，pH则显著降低，由6.04降至5.11。随着饱和度增加，pH降低速度减缓。文献中虽可查到不同硫酸按饱和度下所需硫酸按的量，但在实际操作中，体积的变化很难控制。pH变化则会导致部分弱酸性蛋白沉淀，给分离蛋白质带来困难。通过研究不同饱和度硫酸按的体积和pH值变化，用预先配制的不同饱和度、相同pH值的硫酸按溶液，可有效的避免由于体积和pH值变化所致的误差。由于虾过敏原蛋白的等电点约4.8，硫酸氨溶液的pH在5.1附近，很容易导致虾过敏原蛋白由于电荷的原因而沉淀。固定硫酸氨溶液的pH值在7.5，消除了pH值变化因素的影响，取得了较好的效果。与大量硫酸氨相比，加入少量过敏原蛋白对溶液体积没有明显的影响，可忽略不计。此外，本研究在获取沉淀时，用相应饱和度的硫酸氨溶液洗涤沉淀，有效的去除了沉淀表而残留的上清液，对沉淀中的蛋白质有很好的净化效果。3.2不同硫酸按饱和度样品SDS-PAGE分析用电泳法可测定不同硫酸氨饱和度条件下蛋白质沉淀的变化。图1为不同硫酸按饱和度下虾过敏原提取物的电泳图，并用GIS系统对蛋白质条带灰度扫描。图1饱和度30%~60%硫酸铵沉淀的上清液和沉淀液的电泳图结果表明，在30%上清液中，虾过敏原含量占总蛋白质量的53%；而在40%，50%，60%4硫酸氨浓度的上清液中占29%，23%，25%。对硫酸氨沉淀后沉淀物的电泳可见，30%的沉淀中，虾过敏原蛋白占总蛋白质量的90%，而在40%，50%，60%的沉淀中分别为81%，76%，67%。由图1可见，在40%，50%，60%硫酸氨饱和度的沉淀中，杂蛋白含量明显增加，降低了目的蛋白质的纯度。综合不同饱和度硫酸氨的条件下上清液和沉淀中过敏原含量的变化，表明30%硫酸氨沉淀中的过敏原蛋白纯度最高。考虑到后续的纯化，本研究在纯化虾过敏原蛋白时选用30%硫酸氨饱和度进行沉淀。3.3过敏原蛋白的柱层析纯化及分析为进一步验证本研究的结果，将30%和50%硫酸按沉淀的虾过敏原蛋白经过SephdexVG-100凝胶柱层析，收集蛋白质组分进行SDS-PAGE分析，见图20图2不同饱和度沉淀的虾过敏原蛋白凝胶层析后的组分分析电泳图结果表明，在30%饱和度沉淀的虾过敏原蛋白经凝胶柱层析纯化后，显示该样品只有1条带；50%饱和度沉淀的虾过敏原蛋白，有2条以上的条带，不能取得满意的效果。分析其原因是，虾过敏原由2个亚基组成，每个亚基的相对分子质量均约36X103，未变性前其相对分子质量约为72X103。我们认为在20X103出现的条带是肌钙蛋白的一条，过敏原纯化时这个蛋白质是最难消除的，其性质和过敏原有很多相似之处，相对分子质量约80X103，由3个亚基组成，其中1条亚基的相对分子质量约20X103。变性电泳时，亚基分开，导致在约20X103处出现此条带。这可能是无法分离好的原因。4结论硫酸氨溶液的体积随着饱和度的增加而改变，90%饱和度时比原始体积增加19.12mL，pH从6.04变为5.11。通过配制30%硫酸氨饱和溶液，调pH为7.5，将过敏原加入硫酸氨溶液，使得虾过敏原蛋白能有效的分离，通过进一步柱层析能得到电泳条件下只有1条带的样品，为大量纯化高纯度的虾过敏原提供了技术支持。由于在硫酸氨沉淀过程中一些参数变化可能对实验结果有较大的影响，操作时须严格控制沉淀条件，以保证实验结果良好。5参考文献[1]HughesDA,Mi11sC.Foodallergy:aproblemontheincrease[J].Biologist(London),2001,48(5)：201-204.[2]SteensmaDP.Thekissofdeath:asevereallergicreactiontoashellfishinducedbyagood-nightkiss[J].MayoClinProc,2003,78(2)：221-222.[3]Ranc镕，DutauG.Asthmaandfoodallergy:reportof163pediatriccases[J].ArchPediatr,2002,9Suppl3:402-407.[4]KhooJ,Shekt，KhorFS,etal.PatternofsensitizationLocommonenvironmentalallergensamongstatopicSing叩orechildreninLhefirst3yearsoflife[J].AsianPac,JAllergyImmunol,2001,19(4):225-229.