蛋白修饰与自噬起始新关系

蛋白修饰与自噬起始新关系——核内外蛋白互作摘要：细胞自噬的研究是目前生物也学领域热点之一。细胞自噬是一种进化上保守的，通过吞噬降解自身大分子物质或细胞器来维持细胞生存的活动。随着研究的深入，已经发现大量与细胞自噬起始有关的因子，在实验中发现，自噬起始因子LC3对自噬过程有重要的调节作用，自噬起始因子LC3够在细胞核内被去乙酰化酶Sirt1去乙酰化，进而与核蛋白DOR结合转运至胞质内发挥自噬起始功能。本文将从细胞自噬的简介、自噬起始因子LC3检测及自噬过程中核内外蛋白互作等方面揭示蛋白修饰与自噬起始新关系。关键字：自噬；LC3；GFP-LC3转染体；互作1.细胞自噬自噬是指一些需降解的蛋白质和细胞器等胞浆成分被包裹，并最终运送至溶酶体降解的过程，自噬性降解产生的氨基酸和其他一些小分子物质可被再利用或产生能量。自噬大致被分为以下三种:巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy)。【马泰,孙国平,李家斌.细胞自噬的研究方法[J].生物化学与生物物理进展.2012,39(3):204-209】细胞正常情况下很少发生自噬，当存在诱发因素，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳，以利于细胞快速适应恶劣环境。诱发细胞自噬的因素有很多，根据细胞所处环境及自噬发生的程度不同，可以分为细胞内因素和细胞外因素。其中细胞内的因素有细胞代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等。与细胞内因素相比，细胞外因素对自噬的发生影响更强烈，是细胞应对外界刺激的一种保护反应。缺少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下，细胞的自噬水平在短时间内剧烈升高。【王雄,谭璐.自噬研究进展[J].亚太传统医药.2010(10):144-145】自噬主要有三大功能:1)自噬是营养缺陷下的细胞适应性反应，通过其降解产物来合成氨基酸以及其它一些新陈代谢和生物合成所必需的元素。2)自噬也可以被看作是一种维持内环境稳定的机制，包括再生老化的蛋白质、过氧化物酶、线粒体以及调节内置网的大小，清除不需要的和损伤的细胞器和分子。3)自噬在特定的组织中还有特殊的功能:如参与肺泡II型细胞表而活性物质在细胞内合成:在红细胞成熟过程中负责清除线粒体、核糖体等，在红细胞成为双凹状形态过程中起重要作用。【高冬梅.细胞自噬分子机制以及与肿瘤及肿瘤治疗的研究进展[J].热带病与寄生虫学.2007(01):62-64】2.自噬发生的过程自噬发生需要经过以下几个阶段:自噬前体形成;自噬前体延长包裹自噬的底物，自噬体形成;自噬体与溶酶体融合完成底物降解。当细胞接受自噬诱导信号后，在细胞质中形成一个杯状的双层膜结构的自噬前体，自噬前体在一些自噬蛋白的作用下逐渐延长延长的自噬前体，包裹降解底物，最终形成完全闭合的泡状自噬体。最后，自噬体通过胞内运输系统到达溶酶体，自噬体外膜和溶酶体膜融合，并在溶酶体的水解酶作用下将其包裹物降解。二者的内容物合为一体，自噬体中的物质也被降解，产物氨基酸、脂肪酸等被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。【方梦蝶,刘波,刘伟.自噬的分子细胞机制研究进展[J].中国细胞生物学学报.2012,34(4):382-390】3.自噬起始因子LC3自噬过程由一系列自噬相关蛋白(Atg蛋白)介导完成，这些蛋白质在自噬体形成的不同阶段发挥作用。微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociatedprotein1lightchain3,MAPlLC3,LC3)是哺乳动物中酵母自噬相关基因atg8的同源体，是自噬起始因子。细胞内存在两种形式的LC3蛋白:LC3-Ⅰ和LC3-II。LC3蛋白在合成后,被Atg4蛋白酶切去C末端120位以后的氨基酸序列，暴露出120位的甘氨酸残基，形成胞浆型LC3（即LC3-I），LC3-I散在分布于细胞浆内。自噬发生时LC3-I可被招募至自噬体膜上，LC3-I会酶解掉一小段多肽，转变为LC3-II并定位于自噬体内膜和外膜。与其他一些定位于自噬性结构膜上的Atg蛋白不同(仅在自噬过程的某一阶段发挥作用)，LC3-II始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记。LC3-II/I比值越大，自噬水平越高。【眭怡群,冯一中.自噬相关基因LC3,Beclin-1与凋亡相关基因p53、BCL-2在大肠癌中的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志.2012,28(3):282-286.】LC3-I在胞浆内弥散分布，LC3-II聚集于自噬体膜上，通过免疫荧光的方法检测内源性LC3-或转染GFP-LC3融合蛋白的表达，自噬诱导后的细胞表现为点状聚集增多。理论上，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况。但该方法存在一定的假阳性。因为内源性LC3有时会同时表达促聚集蛋白，而当转染的GFP-LC3基因表达量太高时可能造成非特异性聚集。同时构建一个LC3蛋白C端甘氨酸突变的GFP-LC3转染体作为阴性对照，因为该C端突变的LC3蛋白不能够与PE结合，因此，可以有效地消除非特异性聚集的影响。【MizushimaN,YamamotoA,MatsuiM,etal.Invivoanalysisofautophagyinresponsetonutrientstarvationusingtransgenicmiceexpressingafluorescentautophagosomemarker[J].MolBiolCell,2004,15(3):1101一1111.】4.核内外蛋白互作最新研究表明，细胞自噬关键起始因子LC3能够在细胞核内被去乙酰化酶Sirt1去乙酰化，进而与核蛋白DOR结合转运至胞质内发挥自噬起始功能。大分子在细胞不同位置之间穿梭能够帮助调控不同细胞活性发挥的时间和强度。饥饿和雷帕霉素(Rapamycin)可以诱导细胞核内LC3移位到细胞质，并且成为自噬泡膜结合形式LC3的主要来源。参与自噬起始过程的关键起始因子LC3能够在细胞核与细胞质之间循环，当细胞处于饥饿状态或Rapamycin诱导状态，细胞核内的LC3能够被去乙酰化酶Sirt1进行去乙酰化，发生选择性激活。LC3的K49和K51能够被sirt1识别并进行去乙酰化，发生了去乙酰化的LC3进一步与核蛋白DOR相互作用，通过DOR重新回到细胞质内，LC3出核后先在细胞核旁类似反面高尔基体的地方聚集，进而与Atg7以及其他自噬因子结合，发生磷脂酰乙醇胺修饰连接到发生自噬起始的膜上。LC3的乙酰化水平与各种自噬因子使得LC3从核内转移到细胞质，改变了LC3的分布情况，保证了LC3以一种激活形式从核内到胞质发生重新分布，从而在细胞自噬起始过程中发挥正常功能，保证细胞应对营养匮乏状态。【RuiHuang,YinfengXu,WeiWan.DeacetylationofNuclearLC3DrivesAutophagyInitiationunderStarvation[J].2015(3):393-395】当处于饥饿状态的细胞重新恢复到正常状态时，自噬泡明显减少，LC3又恢复正常分布。这一结果提示饥饿诱导的LC3出核是可逆的。Rapamycin刺激与饥饿处理不同的是，即使去除rapamycin，细胞内的自噬泡并没有发生显著下降，LC3也没有重新在核内分布，说明rapamycin诱导的LC3分子出核是不可逆的。这种现象的出现可能是由于rapamycin进入细胞抑制了mTOR的活性，而这种作用不会因为rapamycin药物的去除而很快消失。这部分结果提示mTOR活性被抑制会诱发LC3出核。除了抑制mTOR活性外，自噬的诱导同时依赖3型PI3K的活性，PI3K以PI为底物获得PI3P，PI3P在自噬泡的延伸和不断补充Atg蛋白过程中起重要作用。【黄锐.Sirt1调控核内LC3脱乙酰化在自噬中的作用研究[D].浙江大学.2013.】5.总结综上所述，自噬是一个随时间不断变化的动态过程，自噬的发生经过了自噬前体形成;自噬前体延长包裹自噬的底物，自噬体形成;自噬体与溶酶体融合完成底物降解等过程。细胞自噬关键起始因子LC3能够在细胞核内被去乙酰化酶Sirt1去乙酰化，进而与核蛋白DOR结合转运至胞质内发挥自噬起始功能。通过免疫荧光的方法转染GFP-LC3融合蛋白的表达，同时构建一个LC3蛋白C端甘氨酸突变的GFP-LC3转染体作为阴性对照，从而可以有效地消除非特异性聚集的影响，确定自噬体的数目和自噬情况。作为真核细胞中重要的物质降解过程，自噬的分子细胞机理和生理病理意义正在被逐渐认识和解析。然而，有关自噬相关基因的功能和自噬的发生机制等还有待进一步研究，如自噬泡膜的来源、自噬前体的生长和闭合以及自噬泡与溶酶体的融合机制等。相对于低等真核生物，哺乳动物的自噬涉及更多的自噬基因，其调控过程更为复杂。为应对不同的外界环境刺激，细胞中的信号通路如何精密调节自噬的发生还不是很清楚。自噬在细胞生与死的决定中扮演的角色还存在争议，在肿瘤发生、免疫性疾病、神经退行性疾病和代谢性疾病中的作用和意义也有待明确。通过调节自噬过程来治疗这些疾病在临床上还需要更多的尝试和验证。【张梅,黄保军,胡梅琼.脂多糖诱导巨噬细胞自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体的形成[J].安徽医科大学学报.2012.47(4):357-361】