蛋白纯化protocol

诱导表达1、挑取含重组质粒的单菌落至５mlLB（含抗性）培养基中37℃过夜培养。2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将５０µl菌接种到含５mlLB（含抗性）培养基的5ml试管中,37℃震荡培养至OD600≌0.4－0.8（最好0.6，单抗大约需２－２.5hr，双抗大约需３－３.５hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续在合适温度下震荡培养４hr。4、分别取菌体0.5ml,离心10000g×1min收获沉淀，用４０µl蛋白loadingbuffer重悬，混匀，煮沸５min。5、离心10000g×5min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。蛋白质纯化亲和层析一、样品准备1)准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-20℃或立即进行步骤2操作。2)用BindingBuffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。再加入1/20细胞生长体积的BindingBuffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。3)10000g，4℃离心20－30min。取上清，置于冰上备用或-20度保存。二、层析1)将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。3)用大约5倍柱体积的BindingBuffer洗，流速控制在0.5-1ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化4)分别用2－5倍柱体积的梯度ElutionBuffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。待清楚纯化条件后，就可只使用2个咪唑梯度纯化。5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。三、柱材料处理1）用大约10倍柱体积的StripBuffer洗，流速1ml／min。2）用大约10倍柱体积的ddWater洗，流速1ml／min。3）用大约10倍柱体积的ChargeBuffer上镍，流速1ml／min。4）用大约5倍柱体积的ddWater洗，流速1ml／min。5）用大约10倍柱体积的BindingBuffer平衡，流速1ml／min。四、附件：溶液配方BindingBuffer20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,5mM咪唑ElutionBuffer20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,1M咪唑ChargeBuffer50mMNiSO4（Nicl2）StripBuffer20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,100mMEDTA离子交换层析法离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为H+型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6。两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、SDS－PAGE等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。凝胶层析凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。（一）原理凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。（二）葡聚糖凝胶的种类与性能葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。表1－8Sephadex1的种类与特性型号分离范围（分子量）吸水量（ml/g）最小溶胀时（h）20℃～25℃100℃床体积（ml）/干凝胶（mg）G10＜7001.0±0.1312~3G15＜15001.5±0.2312.5~3.5G25＜50002.5±0.2314~6G501500～200008.0±0.3319~11G753000～700007.5±0.524112~15G1004000～1500010.0±1.072115~20G1505000～80000015.0±1.572120~30G2005000～30000020.0±2.072130~40G25、G50有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G75～G200又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。表1－9DEAE－纤维素与Sephadex1比较项目DEAE纤维素Sephadex交换量小较大非特异性吸附较大小分离纯度较好好分离时间较粗较长应用范围较窄较宽预处理繁琐方便（三）试验方法1．凝胶的选择根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。2．凝胶的预处理称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定（见表1－10）。表1－10凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量（g）直径（cm）高（cm）容量（ml）G25G50G100G2000.9159.52.510.60.30.93019521.20.60.960381042.51.21.620401042.51.21.640802085.02.41.67014035149.04.41.6100200502012.562.64021050201272.670370903520122.62.61006053010001302505011030701735为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。3．装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。4．加样与洗脱样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/LpH6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/LNaCl）和0.1Mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/LNaCl）。5．洗脱液收集同离子交换层析。6．凝胶柱的重复使用与保存当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：⑴在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。⑵用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。⑶长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。蛋白质在纯化分离后，需要把纯化过程中引入的有害离子除去，或者更换缓冲液，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用需要的缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。1.透析袋处理：透析袋在缓冲液（10mMNaHCO3，1mMEDTA）中煮沸15－30min。2.用ddWater清洗透析袋内部数次，然后装入要透析的蛋白，放在透析缓冲液里透析。处理后的透析袋不要用手直接触摸，要带手套操作。注意事项：在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。一、原核蛋白表达及纯化1、怎样提高E.coli中6′His标签蛋白的表达水平？6×His标签蛋白的表达水平低原因可能为：目标蛋白有毒或不稳定，或者是细菌生长过程中不能维持表达结构。有时候，插入片段的5’端序列编码了干扰转录或翻译的元件（比如有反向重复序列而形成茎环结构，掩盖了Shine-Dalgarno序