蛋白质与其他物质的相互作用-.

1蛋白质与其他物质的相互作用蛋白质的简介•在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的70%以上，种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆品）、精细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广泛。•在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。2蛋白质与化学物质相互作用的原因•球状蛋白三级结构的主要特征：•绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，内部的空间约有75％被原子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小分子，可以与一些晶体的情况相比。•可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是“非极性在内，极性在外”。大量蛋白质的X射线晶体衍射分析统计的结果充分证明了这一规律。3•存在于蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链，约有63％是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、有氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；带电的残基，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有4％。约95％的带电的侧链是分布在蛋白质的表面；约14％的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。•在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的表面也常见到一些疏水的残基。这些“异常”分布的残基，致使肽链的局部结构发生“扭曲”，一些键的张角与一般正常的值有所偏离，蛋白质中这些局部的构象具有相对偏高的能量，相对地处于较不稳定的状态，在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。4•原则上，一些相对规则的-螺旋和-折叠分布在球状蛋白的内部，而且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结构；那些连接-螺旋和-折叠叠的规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的“无规”卷曲，则更多地是分布在球状蛋白的外周。•还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量不同的水分子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性的原子形成氢键。其中一些水分子也参与了蛋白质功能的行使。5•球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，多数球状蛋白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面积的两倍。•球状蛋白质分子的立体结构具右高度特异性和高度灵敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构象的特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特异的结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。•6•在生物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受体的小分子激素和神经介质、血红蛋白的O2等。因此，生物体内的蛋白质是处于一种可以相互转变的多种构象的平衡态.•球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些“裂隙”或“洞穴”，在“裂隙”或“洞穴’’的周围常常是疏水性的：这些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白质(酶)的活性部位所在。7硫氧还蛋白的结构紧密结合水亲水性残基疏水性残基蛋白质与化学物质的相互作用•1、沉淀作用•2、变性作用•3、稳定作用•4、化学修饰作用。9化学物质对蛋白质的沉淀作用•由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。•根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用。•蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。10沉淀作用的类型可逆沉淀不可逆沉淀抗体-抗原沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，又称为变性沉淀。抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。这种特殊的沉淀作用是生物体免疫功能的基础。•沉淀作用主要包括盐析、金属离子沉淀、等电点沉淀、有机物沉淀、聚合物沉淀等。•1、盐析：当向蛋白质溶液中加入无机盐到一定程度时，蛋白质的溶解度减小，称为无机物沉淀。这是由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产生沉淀。•通常情况下含高价阴离子的盐，效果比低价的盐好，但高价阳离子的效果不如低价阳离子。•最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。12•2、金属离子沉淀•一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类：•第一类为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。•第二类为Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和蛋白质分子表面的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。•第三类为Ag+，Hg2+和Pb2+能和蛋白质分子表面的巯基相结合。13•金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。•在这些离子中，应用较广的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和Mn2+，而Cu2+，Fe2+，Pb2+，Hg2+等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。如Zn2+可用于沉淀杆菌肽(作用于第4个组氨酸残基上)和胰岛素；Ca2+(CaCO3)用于分离乳酸，血清清蛋白等。14•3、等电点沉淀•蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。•等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。•等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低pH比较敏感。pH对-乳球蛋白溶解度的影响•4、有机物沉淀•有机溶剂：当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大。•在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。导致蛋白质分子聚集而沉淀。•一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮。当蛋白质的溶液pH接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。•酚类化合物及有机酸沉淀：当蛋白质溶液pH小于其等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。•这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。•单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解离而带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的表面，然后在蛋白质分子之间形成多点交连而成网络结构，最终导致聚集而沉淀•5、聚合物沉淀•非离子型聚合物沉淀法：许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和双水相的形成有联系。因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用而被广泛使用。•聚电解质沉淀法：有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在pH值低于等电点时使蛋白质沉淀。但加入量不能太多，否则会引起胶溶作用而重新溶解。化学物质对蛋白质的稳定作用•许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋白溶液在37C放置的半衰期仅几个小时。•这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。•1、强酸和强碱•强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的pH，引起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基酸残基所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化，造成蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。•另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易被水解断裂，天冬酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，改变了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重新排布，结果导致蛋白质失去活性。21•2、氧化剂•各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。其中酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌，后者可以与蛋白质表面的巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。在碱性条件下，半胱氨酸可以被Cu2+氧化成次磺酸或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。•分子氧、H2O2以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自由基等是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧化失活主要是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、过氧化氢、过氧化物）来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋白质失活。22•3、去污剂和表面活性剂•去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具有长链疏水尾和亲水的极性头。当少量的阴离子去污剂（如十二烷基硫酸钠，SDS）单体加入到蛋白质溶液中时，去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，随着加入量增加，与蛋白质的结合位点达到饱和，这时去污剂则以协同方式结合于蛋白质其它位点，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂结合，直到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性。23•4、变性剂•高浓度脲（8-10mol/L）和盐酸胍（6mol/L）常常用于蛋白质变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键，引起蛋白质不可逆失活。•有机溶剂:水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质失去活性，是因为有机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，并通过疏水作用与蛋白质结合，改变了溶液的介电常数，从而影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡•螯合剂•结合金属离子的试剂，如EDTA等可以使金属酶、金属蛋白失活，这是因为EDTA与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅助因子造成的。螯合剂可以螯合对蛋白质有害的金属离子，使那些不需要金属离子的蛋白质稳定。24蛋白质不可逆失活的化学因素强酸和强碱强的酸碱可以改变蛋白质溶液的pH引起蛋白质表面必需基团的电离，使蛋白质的空间结构发生变化，造成蛋白质分子聚集，导致变性。氧化剂氧化剂甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌再与巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。表面活性剂变性剂重金属离子去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露从而使蛋白质发生不可逆变性。脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键。有机溶剂也会引起蛋白质变性失活Hg2+、Cd2+、Pb2+能与蛋白质分子中的半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反应，使蛋白质不可逆沉淀而变性失活。化学物质对蛋白质的稳定作用•在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以通过化学方法使蛋白质稳定。其中常用的方法有以下几种：•固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载体、高分子载体）；•添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧化、不受变性剂变性等•化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。26稳定剂共溶剂糖类，醇氨基酸及其衍生物无机盐，甘油，聚乙二醇等常用1-4M浓度共溶剂来稳定蛋白质和细胞器。抗氧化剂底物、辅酶金属离子化学交联剂半胱氨酸，2-巯基乙醇还原谷胱甘肽，二巯基赤藓醇等巯基试剂可防止巯基氧化植物抗氧化剂如儿茶酚黄酮等也具有保护作用酶可被底物辅酶、竞争性抑制剂及反应产物等所稳定。金属离子不仅可以影响酶的活性，还可以影响酶的稳定性如Ca2+多位点结合使得蛋白质分子成为紧密的活性形式。交联剂