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1、易错PCR:通过调整反应条件来使PCR扩增过程中复制错配率增加，在目的基因中随机引入突变，继而获得蛋白质分子的随机突变体*提高镁离子浓度或加入锰离子*降低体系中一种的dNTP浓度（至少5-10%）*运用低保真度DNA聚合酶*增加DNA聚合酶的浓度属于无性进化：单一基因内进行遗传突变，费力、耗时，多用于小片段（800bp以下）2、酶的概念：酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（substrate）具有高效催化作用的生大分子，包括蛋白质和核酸3、辅酶:与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去(NAD+)。辅基:与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去(FAD、FMN)酶的活性中心：或称活性部位，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。4、抗体酶或催化抗体：是具有催化功能的抗体。本质：免疫球蛋白，即具有催化作用的免疫球蛋白5、酶促反应特点：①酶促反应具有极高的效率②酶促反应具有高度的特异性：绝对特异性、相对特异性、立体结构特异性③酶促反应的可调节性：对酶量的调节，对酶活性的调节6、诱导契合假说：酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。7、底物浓度对反应速度的影响：①当底物浓度较低时：反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。②随着底物浓度的增加：反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。③当底物浓度高达一定程度：反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应8、Km与Vmax的意义9、不可逆性抑制作用：抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合，使酶失活。可逆性抑制作用：抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。类型：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。三种抑制剂的特点10、酶的调节：酶活性的调节（快速调节）①酶原与酶原的激活②变构（別构）酶③酶的共价修饰调节酶含量的调节（缓慢调节）①酶蛋白合成的诱导和阻遏②酶降解的调控11、酶原激活的意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。（消化管内的蛋白酶）有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。（凝血酶与纤溶酶类）12、变构调节一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节13、两种操纵子：乳糖操纵子、色氨酸操纵子14：细胞破碎法：实验室小规模①旋刀匀浆法②研磨法③高速珠磨法④反复冻融⑤渗透压破碎法⑥超声匀浆法大规模提取：高压匀浆法15、解吸方法--洗脱原理①加大反离子的浓度，常用的反离子是NaCl②改变溶液的pH（改变结合基团的电荷）③同时改变pH与离子强度交换剂选择的一般原则：*酶蛋白稳定存在的pHpI，用阳离子交换剂*酶蛋白稳定存在的pHpI，用阴离子交换剂*两种pH条件下均能稳定存在，二种交换剂均可4、蛋白质与酶的结构和功能16、氨基酸的分类：17、拉氏构象图：两相邻肽键平面可相对旋转（构象角φ,ψ）：围绕Cα旋转的构象与角度18、蛋白质一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序。主要化学键：肽键（+二硫键）19、α螺旋(α-helix)：多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的右手螺旋构象。简言之，各个肽平面围绕同一轴旋转形成的右手螺旋构象。两亲性螺旋：（重要）氨基酸侧链从螺旋骨架伸出，形成螺旋表面一侧亲水（带电、极性），一侧疏水（易形成疏水内核或疏水表面聚合）的特性。螺旋转轮：螺旋沿着螺旋轴的二维投射图，可以判断alpa螺旋是否具有两亲性。影响α-螺旋稳定因素：⑴侧链基团空间位阻：如Ile、Trp、Phe侧链基团；⑵连续氨基酸侧链基团带有相同电荷（同种电荷互斥）⑶Pro等亚氨基酸存在（不能形成氢键,且Cα参与吡咯环形成，环内Cα-N和C-N键不能旋转）。20、motif的层次、线性motif的概念（重要）21、四级结构：两条和两条以上多肽寡聚蛋白或多聚蛋白质形成的高级结构。亚基种类、数目、空间排布以及亚基互作是四级结构稳定因素。5、蛋白质与酶的修饰技术1、酶分子修饰的概念和意义：概念：通过各种方法改变蛋白/酶的分子结构，从而改变其某些特性和功能。主要途径有化学途径和分子生物学途径。意义：①提高蛋白/酶的活力,满足/适应生产工艺的要求②增强蛋白/酶的稳定性③提高、降低或消除蛋白/酶的抗原性④研究和了解蛋白/酶的结构：⑤弥补天然蛋白的不足，赋予优良性状2、化学修饰的手段与方法：经常被修饰的残基：亲核：丝、半胱、甲硫、苏、赖、组亲点：酪、色3、侧链基团的修饰（1）羧基修饰反应----------水溶性碳二亚胺类（最标准）、硼氟化三甲烊盐（2）氨基修饰：采用某些化合物使酶分子侧链氨基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的方法称为氨基修饰①亚硝酸②2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、③④（3）巯基修饰：巯基在许多酶中是活性中心的催化基团，巯基还可与另一巯基形成二硫键，因此对稳定酶的结构和发挥催化功能具有重要的作用。常用修饰剂：烷基化试剂（碘乙酸、碘乙酰胺）、马来酰亚胺（4）咪唑基修饰：组氨酸(咪唑基)位于许多酶的活性性中心。常用咪唑基修饰剂：焦碳酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸（5）酚羟基（酪氨酸）修饰反应：Tyr（酪氨酸）残基修饰主要是酚羟基的修饰，Thr和Ser残基修饰为羟基修饰，但反应条件苛刻（6）胍基(精氨酸）化学修饰反应：采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环，从而改变酶分子空间构象的方法。修饰剂：丁二酮、1，2-环己二酮、丙二醛和苯乙二醛（二羰基化合物）（7）吲哚基(色氨酸)化学修饰反应：4、大分子结合（共价）修饰：修试剂：聚乙二醇（PEG）、单甲氧基聚乙二醇（MPEG）、右旋糖酐5、分子内交联修饰：双功能基团化合物（双功能试剂）：戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶稳定性的修饰方法。6、金属离子置换修饰：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。作用如下：①阐明金属离子对酶催化作用的影响②提高酶活力③增强酶的稳定性④改变酶的动力学特性7、氨基酸化学置换修饰：将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。缺点：难度大，成本高，专一性差，而且对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。8、蛋白质片段嵌合修饰：一个天然多肽与一个人造多肽（或化学修饰）相缔合，产生半合成结构9、分子生物学方法：定点突变技术10:、细胞内修饰：6、蛋白质与酶分子设计1、蛋白质分子设计的分类①“小改”：定位突变和化学修饰②“中改”：结构域进行拼接组装③“大改”：完全从头设计全新的蛋白质2、蛋白质与酶分子设计原理（重要）1．内核假设：蛋白质在进化中，由氢键连接的二级结构保守内部单元组成区域（骨架）。2．内部密堆积，无重叠。3．内部氢键是最大限度满足的(主链及侧链)。4．最优的氨基酸侧链几何排列5．疏水基团与亲水基团需合理分布：需安排少量的疏水基团在表面，少量的亲水基团在内部。6．金属蛋白配位残基的替换应满足金属配位几何，且金属中心与外围第二壳层相互作用十分重要7．结构和功能具有专一性（蛋白质设计最困难问题3、先导化合物：即原型物，是通过各种途径或方法得到的具有一定生物活性的化学物质，有可能进一步优化（活性不高、特异性差、毒副作用大、或药代动力学性质差）而得到供临床使用的药物。4、不同氨基酸的特征：估计就选择：5、从头设计法：是指基于对蛋白质折叠规律的认识，从氨基酸的序列出发，设计制造自然界中不存在的全新蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期的功能。8、固定化酶与固定化细胞1、酶固定化：采用各种方法，将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程成为酶的固定化。方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法.2、四种方法的比较1)吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定的方法，又称为物理吸附法常用吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、载体廉价、可反复使用。缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落2)包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分为：凝胶包埋法和半透膜包埋法（微囊化法）凝胶包埋法：半透膜包埋法：适用于底物和产物都是小分子的酶的固定化。半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等3)结合法：分为离子键结合法和共价键结合法离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。优点：条件温和、操作简便、活力损失少。缺点：酶与载体结合不牢固，使用时需严格控制好pH值、离子强度、温度等操作条件。共价键结合法：通过共价键使酶与载体结合的固定化方法。载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。方法：重氮法、叠氮法、溴化氰发、烷基化法4)交联法：利用双功能试剂，在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的方法。交联试剂：戊二醛（常用）、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。优点：结合牢固，酶不会脱落，可长时间使用。缺点：交联反应条件激烈，酶的多个基团被交联，致使酶的活力损失大。制备的固定化酶颗粒较小，不便于使用。2、细胞的固定化：固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动的细胞。常用凝胶包埋法优点：缺点：3、固定化酶优点：缺点：9、酶的非水相催化1、非水介质酶催化反应优点：2、酶的非水相催化类型：1)有机介质中的酶催化：酶在含有一定量水（结合水和溶剂水）的有机溶剂中进行的催化反应。反应体系：A.微水介质体系、B.与水溶性有机溶剂组成的均一体系、C.与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系、D.正胶束体系（水包油）、E.反胶束体系（油包水）适用于：疏水性物质（底物或产物）的酶催化作用反应体系：两相界面进行最适水含量：催化反应速度达到最大时的水含量水活度：描述有机溶剂中酶活性与水含量关系，即为一定压力和温度下，反应体系中的水摩尔分数与水活度系数的乘积。它看直接反映体系中的水分情况，与反应体系中的水含量和有机溶剂的极性无关。不同的酶有不同的最佳水活度。极性系数lgP：反应有机溶剂与酶活力之间的关系（P为溶剂在正辛醇和水中的分配系数）。lgP越大，表明其极性越小，疏水性越强。极性较强有机溶剂，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境水化层，降低酶催化活性，甚至导致酶变性失活。一般选用2≤lgP≤4的有机溶剂作为有机介质为宜2)气相介质中的酶催化：适于底物为气体或者能够转化为气体物质的酶催化反应。3)超临界流体介质中的酶催化：超临界流体：温度和压力超过某物质超临界点的流体。常见的有：CO2、水、氨、甲醇、乙醇、乙烯。超临界流体具备的条件：4)离子液介质中的酶催化：离子液：在室温条件下，有机/无机阴-阳离子低熔点盐液，呈液态的，挥发性好、稳定性好典型离子液：含氮有机阳离子和无机阴离子3、酶的非水相催化特性4、有机介质中酶催化反应：5、酯化反应：脂肪酶是工业上最常用的酶之一。研究表明，在水溶液中它催化油脂和其他酯类的水解反应，而在有机介质中它催化水解反应的逆反应－酯合成反应及酯交换反应。类型：位置选择性酯化反应、消旋化合物选择性酯化反应、消旋化合物的拆分、内酯合成反应6、有机介质中酶催化反应的条件及控制①酶的选择②底物的选择和浓度控制③有机溶剂的选择④含水量的控制⑤温度控制⑥pH值的控制