蛋白质分子基础复习整理笔记

整理：许智润2011年末考试覆盖率100%1蛋白质分子基础题型：名词解释5-6个简答题4个问答和计算3个问答肯定有一题是实验设计有一题是蛋白质一级结构的测定附加题目录第一章绪论氨基酸.......................................................................................................................1第二章蛋白质制备.........................................................................................................................4第三章蛋白质一级结构测定.......................................................................................................10第四章蛋白质的化学修...............................................................................................................15第五章肽的人工合成...................................................................................................................17第六章蛋白质的分子构象...........................................................................................................17第七章蛋白质的结构与功能关系...............................................................................................19每章需掌握的知识（P.S结合了老师最后一节课的内容，但最好不要只按照这个来复习，有空一定要看PPT看书；否则挂了可不要怪我哦！）第一章绪论氨基酸常见20种氨基酸及其疏水性、亲水性、带电性、代号、旋光性、等电点疏水性、亲水性：亲水性(极性R基)不带电荷丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺带电荷(强亲水性)(碱性)带正电赖氨酸、精氨酸、组氨酸(酸性)带负电天冬氨酸、谷氨酸（怀疑PPT的天冬酰胺、谷氨酰胺上打错）疏水性（非极性R基）丙氨酸(R基的疏水性最小）、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸甘氨酸：R基为-H，可算作疏水性氨基酸，又可以划到亲水性氨基酸。甘氨酸的a-碳不是手性碳，故没有旋光性。不带电荷的极性R基氨基酸：带有-OH(Ser、Thr、Tyr)、-SH(Cys)、酰胺基(Asn、Gln)整理：许智润2011年末考试覆盖率100%2代号：甘氨酸Gly脯氨酸Pro苏氨酸Thr天冬氨酸Asp丙氨酸Ala苯丙氨酸Phe半胱氨酸Cys谷氨酸Glu缬氨酸Val酪氨酸Tyr甲硫氨酸Met赖氨酸Lys亮氨酸Leu色氨酸Trp天冬酰胺Asn精氨酸Arg异亮氨酸Ile丝氨酸Ser谷氨酰胺Gln组氨酸His名词解释：必需氨基酸：8种，体内不能合成，必须由食物中的蛋白质供给。非必需氨基酸：12种，只要有氮元素存在人体就能自己制造，组成人体蛋白质的重要成份，而且保持一定比例。半必需氨基酸：人体合成速度慢,不能满足人体需求。氨基酸的等电点：氨基酸分子中所含的—NH3+和—COO—数目正好相等，净电荷为0时的环境pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。氨基酸等电点的计算：侧链不带电荷中性氨基酸，其等电点是它的pK'1和pK'2的算术平均值：pI=(pK'1+pK'2)/2酸性氨基酸：（这个是对于含有3个可解离基团的氨基酸来说的，可以看下面的方法）pI=(pK'1+pK'R—COO-)/2碱性氨基酸：（这个是对于含有3个可解离基团的氨基酸来说的，可以看下面的方法）pI=(pK'2+pK'R—NH2)/2对于含有3个可解离基团的氨基酸来说，只要依次写出它从酸性经过中性至碱性溶溶解高过程中的各种离子形式，然后取两性离子两侧的pK值的算术平均值，即可得其pI值。步骤：1由PK’值判断解离顺序，总是PK1’PK2’PK3’…，即谁的PK’值小，谁就先解离。2按照解离顺序正确写出解离方程式：简式，注意解离基团的正确写法。3找出呈电中性的物质，其左右PK’值的平均值就是氨基酸的等电点：PI＝（PK左’+PK右’）/2整理：许智润2011年末考试覆盖率100%3举例：1.半胱氨酸pK1(α-COO-)=1.96，pK2(R-SH)=8.18，pK3(α-NH3+)=10.28，该氨基酸pI值为：A.5.07B.6.12C.6.80D.7.68E.9.232.赖氨酸pK1(α-COO-)=2.18，pK2(α-NH3+)=8.95，pK3(R-NH3+)=10.53，该氨基酸pI值为：A.(pK1+pK2)/2B.(pK2+pK3)/2C.(pK1+pK3)/2D.(pK1+pK2+pK3)/3E.(pK1+pK2+pK3)/23.天冬氨酸pK1(α-COO-)=1.96，pK2(α-COO-)=3.65，pK3(α-NH3+)=9.60，该氨基酸pI值为：A.2.8B.3.65C.5.74D.6.62E.7.51旋光性：从蛋白质温和水解得到的a-氨基酸都是L型的。D-丙氨酸存在于昆虫的幼虫和蛹中。D-亮氨酸存在于短杆菌肽中。在细菌中发现了许多D-型的非蛋白质氨基酸D-谷氨酸和D-丙氨酸存在与细菌细胞壁的肽聚糖中。甘氨酸的a-碳不是手性碳，故没有旋光性。光吸收：220-300nm：Tyr、Phe、Trp苯丙Phe的＝257nm酪Tyr的＝275nm色Trp的＝280nm蛋白质的生物学/行使的功能：新陈代谢的催化剂-酶。有机体的结构成分。储藏氨基酸的功能。运输功能。激素的功能。免疫的功能。接受和传递信息作用功能。调节或者控制功能。整理：许智润2011年末考试覆盖率100%4第二章蛋白质制备蛋白质分离纯化的一般程序及其注意事项1.生物组织的机械破碎:研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等(细胞外分泌物无需破碎)。2.根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。3.离心:去亚细胞颗粒、细胞碎片等4.粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。5.精制：可用层析法、电泳法等进行精制。6.结晶：取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。注意事项：动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。制备植物细胞时，在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变,它可以吸附多酚化合物。革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化，37oC处理15分钟即可溶解细胞壁。革兰氏阴性菌较难消化。可先用非离子去污剂（如TritonX-100）、巯基乙醇或甘油处理细胞。在溶液中还可加入脱氧核糖核酸酶I（10ug/mL），可以使溶液的黏度降低，可以提高抽提液的质量。膜蛋白的释放：外周蛋白通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。占膜蛋白的20~30%内在蛋白（固有蛋白）嵌合在膜脂双层结构中。大部分膜蛋白是固有蛋白外周蛋白的分离：改变离子强度；金属螯合剂（EDTA）可将其抽提出来内在蛋白的提取：提取的原则抽提膜蛋白时，首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合，同时保持疏水基暴露在外的天然状态。此过程叫做增溶作用。常用的增溶剂是去污剂，它可以使膜蛋白疏水部分与膜分离，同时保留住膜蛋白表面的疏水结构。用去污剂增溶之后，膜蛋白要用透析的方法除掉去污剂，再进行其他方法的分离纯化。整理：许智润2011年末考试覆盖率100%5盐析的概念是一种向蛋白质溶液中加入浓的盐溶液使蛋白质变性的方法。盐溶：一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加。盐析：当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出。原因:将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出,导致蛋白质分子的沉淀。课件重点补充：膜蛋白破碎的主要方法：膜蛋白的释放，上面有。蛋白质脱盐：透析法（注：用前在含EDTA的溶液中煮----除去核酸酶和蛋白酶）；纤维过滤透析法；中空纤维超滤膜分子筛层析法；SephadexG-25蛋白质浓缩：沉淀法：用盐析法或者有机溶剂法将蛋白质沉淀，再将沉淀溶于少量溶液中；吸附到离子交换柱上，然后用少量盐洗脱；干燥吸附法：用固体吸附剂如SephadexG25等，冻干法，真空干燥法；渗透浓缩法：将干粉PEG-20000涂在装有蛋白质溶液的透析袋上，可吸干水分；超滤浓缩法：用超滤膜滤去小分子和水，达到超滤的目的。使蛋白质沉淀的主要方法及其原理(重点:盐析方法)盐析法（上面有）；有机溶剂法：原理：1.增大带电质点之间的静电力。2.破坏蛋白质表面的水合层，使蛋白质分子脱水而沉淀。有机聚合物沉淀法；（作用原理与有机溶剂类似）选择性变性沉淀法：适用于提取一些耐极端环境的蛋白质。用一些极端条件，使非目标蛋白质变性析出，从而将目的蛋白质纯化。主要方法有：热变性；pH变性(包括等电电变性)；有机溶剂变性。非特异性层析的原理、方法（如何平衡、如何吸附、如何洗脱….）吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析离子交换层析原理:根据蛋白质分子所带电荷的不同来达到分离的目的.解离离子带负电，结合阳离子（蛋白质分子），称为阳离子交换柱。解离离子带正电，结合阴离子（蛋白质分子），称为阴离子交换柱。步骤：（处理介质-装柱-上样-洗涤-洗脱-介质再生）方法：平衡：电荷量越大,结合越牢,在柱中移动速度越慢;电荷不同,亲和力不同.洗脱：带电蛋白质分子与交换剂的结合可逆。通常,用盐梯度和pH梯度可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来.整理：许智润2011年末考试覆盖率100%6其他：离子交换的支持物纤维素：具有松散的亲水性网络,较大的的表面积、吸附容量大，通透性好。葡聚糖凝胶：既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。琼脂糖凝胶：吸附容量大，能维持较好的流速和分辨率。习题1：三个氨基酸（Leu,Asp,Lys）的混合物，经过一个阳离子交换树脂粒，用pH5的缓冲液洗脱，洗脱液中氨基酸出现的顺序是A．Asp,Leu,Lys;B．Leu,Asp,Lys;C．Lys,Leu,Asp;D．Leu,Lys,Asp解：Leu0,Asp-,Lys+》》》AspLeuLys自己做的，不知道对不对习题2：有以下4种蛋白质的混合物：（1）pI=10；（2）pI=4；（3）pI=8.6；（4）pI=5.若不考虑其它因素，当它们流过DEAE-纤维素阴离子交换柱，用线性盐梯度洗脱时,这些蛋白质的洗脱顺序如何，并具体说明其原因。答案:在离子交换柱上，带更多负电的吸附能力更强。四种蛋白质PI值的顺序为1342。因此，在某种pH值下，所带电荷由正到负的顺序为1342。因此，洗脱出现的先后顺序就是1342。凝胶过滤层析原理：根据分子量的大小不同而达到分离的目的。载体是一种多孔的凝胶。分子直径比凝胶孔径大的分子,不能进入凝胶颗粒的微孔中,其他分子由大到小先后从凝胶中流出。疏水层析(吸附层析)原理：根据蛋白质分子疏水性的不同而达到蛋白质分离的目的。在不带电的载体上偶联上疏水基团形成疏水吸附剂，将带有非极性的生物活性物质吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，将吸附物质解离下来。洗脱：改用低浓度的盐;降低离子强度;加乙二醇。在洗脱也中加去污剂；增加洗脱pH。从高到低的NaCl浓度梯度洗脱；或由高到低