蛋白质分离纯化的一般程序

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品纯化方案是由几种纯化方法组成的，一般选择的依据是从抽提液中有效成分和杂质之间理化性质考虑的。如沉淀法是从溶解度的差异考虑的；离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析分别从电荷、分子量、对配体亲和力的差异性考虑的。为纯化某一有效成分，可选出由两种或更多种方法组成的方案。一般先选粗放、快速、有利缩小样品体积和后工序处理的方法；精确、费时、需样品量少的方法后选。在每一纯化方案中，切忌一种方法重复使用。你好!我也是位毕业的学生.希望能给你提供参考.以下是离子交换层析常见问题分析,希望能解决你的问题1.纯化的蛋白质产率低可能原因及解决方法：树脂上的蛋白质未洗净，可采用增强溶液离子强度，更换活性高的反荷离子或使用去垢剂等办法解决；PH值不合适，若缓冲体系的PH值与目的蛋白的PI相差太远，目的蛋白与树脂的结合会过于牢固；蛋白质发生沉淀，可能是因为缓冲体系PH值过于接近蛋白质PI值，溶液离子强度过低或溶液过渡稀释；蛋白质在初步过滤的时候有损失；蛋白质或者辅助因子在层析时有损失；蛋白质水解酶破坏了目的蛋白；树脂中有纯化时蛋白质失活可能原因及解决办法：某个辅助因子或一部分蛋白质有损失，混合部分收集液，测定活性；蛋白质在现有层析液中不稳定；树脂中有微生物。微生物。3.蛋白质不与树脂结合可能原因及解决方法：初上样缓冲液离子强度过大，降低初始上样缓冲液离子强度；树脂PH值因解析作用而发生变化，注意蛋白质等电点的计算值往往与实验值差别很大；树脂未进行适当平衡；再生的树脂未洗净。4.纯化的蛋白质产率低可能原因及解决方法：树脂上的蛋白质未洗净，可采用增强溶液离子强度，更换活性高的反荷离子或使用去垢剂等办法解决；PH值不合适，若缓冲体系的PH值与目的蛋白的PI相差太远，目的蛋白与树脂的结合会过于牢固；蛋白质发生沉淀，可能是因为缓冲体系PH值过于接近蛋白质PI值，溶液离子强度过低或溶液过渡稀释；蛋白质在初步过滤的时候有损失；蛋白质或者辅助因子在层析时有损失；蛋白质水解酶破坏了目的蛋白；树脂中有微生物。5.蛋白质分辨效果差可能原因及解决办法：层析时流速太快；层析柱过短；上柱蛋白过多；梯度洗脱时洗脱液浓度变化太快；蛋白质可在脱离层析柱后再次混合，尽量减少树脂支持物与部分收集期间的管道体积；不均匀的装柱以至产生碎屑，，上样合洗脱时的错误操作；树脂未进行适当平衡；树脂中有微生物。蛋白质纯化蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性。通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化。其蛋白质分离纯化主要方法包括：（1）根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤(一种柱层析)（2）利用溶解度差别分离：等电点沉淀法）由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度)（3）根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；（4）蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）（5）根据配体特性的分离——亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质）这是一门很深的学问，除了需要高科技还需要科研专用设备，只是简介，希望对你有帮助，不要上当受骗：酶的分离纯化方法简介生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：一、预处理及固液分离技术1.细胞破碎（celldisruption）高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是：溶壁微球菌(micrococcuslysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。2.离心离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121℃温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。3.膜分离技术在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题：第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。因此，料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其工作原理是：当溶液中欲被分离