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目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。5.蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。6.在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。包涵体变性破菌基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用:机械破碎、超声破碎:单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。洗涤溶解一般用强的变性剂如尿素(6-8M)、盐酸胍(GdnHCl6M)，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。KandulaSuntha等人用TritonX-100来溶解Zymononasmobilislevansucrase包涵体蛋白。另外还，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。包涵体复性由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。包涵体蛋白复性方法包涵体蛋白复性效率复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几，如在纯化IL-2时以十二烷基硫酸钠溶液中加入铜离子(0.05%SDS，7.5-30umol/lCuCl2)的方法，25-37°C下反应3小时，再EDTA至1mmol/l终止反应，复性后的二聚体低于1%。[6]一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素蛋白质的复性浓度:正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而，一般浓度控制在0.1-1mg/ml;如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新凝聚的缘故。所以我们采用再水浴和磁力搅拌下，逐滴加入变性蛋白，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。pH和温度:复性缓冲液的pH值必须在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是8.0-9.0。此外，影响复性效率的因素还有，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。提高包涵体蛋白的复性产率氧化-还原转换系统对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。常用的方法有:空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也都有应用。氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。通常使用1-3mmol/l还原型巯基试剂,还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为10:1-5:1。添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。如盐酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于0.4mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。浓度为0.4-0.6ML-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度。成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。PEG-NaSO4两相法用PEG和NaSO4作为成相剂,然后加入盐酸胍，再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进行复性,但这种方法需复性的变性蛋白质的浓度必须低。分子伴侣和折叠酶等这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰-辅氨酰顺反异构酶、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。其它提高复性率的策略还有许多，如:非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂CHAPs、TritonX-100、磷脂、laurylmaltosid、Sarkosyl等对蛋白质复性有促进作用;待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性;多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。[10]折叠复性效果的检测根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。色谱方法:如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。免疫学方法:如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以执行某一些生命活动。当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中发现了一些规律:如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等，并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。3.包涵体的洗涤纯化1包涵体洗涤试剂1.1裂解液50mmol/LTris·Cl（pH7.2），10mmol/LEDTA，300mmol/LNaCl.。1.2BufferI20mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，100mMNaCl。1.32M/4M/8M尿素溶液分别称取2mol/4mol/8mol的尿素，用BufferI定容至1L即可。2工程菌的大量表达从平板上挑生长饱满的单克隆菌落接种于25mlLB（含抗生素），37℃振荡培养过夜。将培养菌液按1:1000扩种，至装有500mlLB（含抗生素）的1000ml三角培养瓶中，培养的瓶数根据需要而定。37℃振荡培养，至OD600nm1.0左右。使菌液冷却，加IPTG至终浓度为0.2mmol/L，25℃，诱导6hr。收集菌体，4℃，10,000g离心4min。以培养液体积的1/50量的裂解液悬浮。冰浴，用超声破碎仪或高压均质机破碎菌体。超声条件为：输出功率70%，作用2sec、间歇4sec为一个脉冲，共作用时间累计30min/100ml裂解液。同时保留上清和沉淀部分，分别制样进行SDS-PAGE分析。3包涵体的洗涤纯化包涵体沉淀以裂解液等体积的2%TritonX100（BufferI溶解）重悬，37℃，振荡30min。4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的BufferI重悬，超声波处理5min/100ml悬浮液。4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的2%TritonX100（BufferI溶解）重悬，37℃，振荡30min。℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的BufferI重悬，37℃，振荡30min。4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的2mol/L尿素溶解，室温搅拌30min。4℃，8,000g，离心10min，上清液为目的蛋白的2M尿素样品；沉淀以等体积