蛋白质工程第四讲分离纯化与分析.

第四讲分离纯化与分析一、分离纯化是分析的重要过程：针对分析目的不同，对分析对象的要求和采取的措施不同。若分析过程干扰很小，特异性很高，不需要对样品处理可直接测定。如：抗原及其抗体检测，配体及其配基等。多数样品常常需要处理，才能满足检测的要求。如：蛋白质结构分析、动力学（变复性）分析、酶学性质研究等，纯度要求很高、避免干扰分析。为了保证分析的准确度，避免检测体系中某些物质的干扰，往往对样品进行处理。二、分离分析的含义：1、分离过程本身可以是分析过程样品干扰严重，需通过分离再检查，分离过程和分析过程耦合，分析性色谱技术（HPLC、TLC）2、分离过程的分析——优化纯化工艺分离过程管理：定性分析、定量分析、纯度、结构和功能分析等3、基本要求：客观、准确性，反映分析对象（目的物质）的真实性。4、分析方法要求：选择性（特异性）、精确度、灵敏度、重复性等第一节概述三、如何理解分离纯化与分析（三个层次）物质的分析离不开分离：分析要求样品的纯度：对样品进行分离纯化：如蛋白质、核酸等结构与功能关系的分析；物质分离纯化过程离不开分析检测：分离组分的收集、纯度、含量和组分分析；即分离过程管理。分离纯化过程即是分析检测过程：电泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄层层析(TLC)等；分析是对事物的感知，是眼睛、是手段一、概述1、一般原理：依据分离对象（物质）的溶解度、大小在相态中的分配等特性对物质进行分离纯化。2、基本程序：样品处理、粗分和精分（例如：蛋白质的分离纯化）3、分类：初级分离：沉淀法、膜分离、萃取法、离心法等精制纯化：吸附层析、凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱、反向色谱、亲和层析第二节分离与纯化二、初级分离（要求：灵活运用）目的——分离对象（物质）初步分离、浓缩、富集的过程。方法及原理：1、沉淀分级分离：盐析分级：中性盐（NH4SO4、Na2SO4等等），例如蛋白酶等蛋白质类等电点分级：有机溶剂：热沉淀：其它：盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、PEG、重金属等联合使用：盐析—等电点盐析原理示意图2、膜分离：–膜分离方法及原理：透析，微滤，纳滤，超滤，反渗透，电渗析–膜材料和特性：•有机膜：（醋酸纤维素、硝基纤维素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等）•陶瓷膜：陶瓷材料–膜组件：管式膜组件，平板式膜组件，螺旋卷式膜组件，中空纤维（毛细管）等–应用：菌体分离，小分子产物分离和回收，蛋白质的分离和回收、浓缩和纯化等，膜生物反应器。3、萃取：4、离心：–分类：低速离心、高速离心、超速离心–分离方式：差速离心、浮力密度离心（连续梯度、非连续梯度）5、其它：盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、PEG、重金属等6、联用方法：膜过滤-盐析—等电点，离心—萃取，离心-盐析—等电点等等B：精制分离—色谱分离：（A）精制过程，纯度较高（B）方法和原理：流动相和固定相的分配系数不同。分配平衡很快，流动相为平推流。（1）吸附分离技术：吸附—解吸附平衡，固定相（吸附剂）—流动相（洗脱剂）分配系数不同和分配平衡。吸附—解吸附—再吸附的连续过程（固相和流动相之间连续分配的过程）吸附剂：吸附剂的选择，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。吸附剂的选择：根据吸附剂性质和被分离对象的性质选择。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于解吸附，对于极性大的分离对象，选择极性小的吸附剂，反之亦然。吸附剂的选择依靠经验和多次试验。吸附剂的种类：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等柱层析：羟基磷灰石，[Ca3(PO4)3OH2]，HA，酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。薄层层析：例如，硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析硅胶薄层层析：硅胶板，硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC（含羧甲基纤维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)，硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化，活化测定（约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯做展层剂，Rf大小苏丹黄苏丹红.靛酚蓝，苏丹黄Rf）0.5，苏丹红和靛酚蓝Rf之差在0.1—0.2)。分析程序：点样，展层，显色。TLC色素指纹图谱和灰度分析图4TLC色素指纹图谱的图像灰度分析曲线Fig.4IntensitycurveofpigmentfingerprintingsonTLC图3色素的TLC指纹图谱Fig.3ProfileofpigmentsfingerprintsonTLCa,OnceDevelopingMethod.b,RepeatedDevelopingMethodT1→T11T11T1-4T10T9T8T7T6T5ab重复展层法：展层剂1为石油醚、正己烷、异丙醇、丙酮和甲醇比例=8-10：0.75-0.95：0.2-0.30：0.8-1.0：0.25-0.35；展层剂2为石油醚：正己烷：异丙醇：丙酮，比例为10：0.95：0.22-0.25：0.38-0.41。重复展层法呈现的TLC指纹图谱能将CQV97菌株全色素分辨成11条不同颜色条带的色素组分，从下而上依次为黄绿色、蓝绿、深蓝绿、绿色、紫色、黄色、黄色、紫色、红色、红棕色和橙黄色聚酰胺薄膜薄层层析：DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），灵敏度10-9~10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下反应。DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。Edman降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯）进行微量蛋白质序列分析（2—10nmol肽样品）。•单向纸层析•双向纸层析•薄层层析（2）凝胶过滤：排阻色谱或分子筛层析，根据分子颗粒大小进行分离原理：分子在筛孔中自由扩散、渗透，由于分子在筛孔中的分配系数不同，将分子分离。排阻的范围为0—100%。分配系数：分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Vt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和Vg分别为床体积、外水体积、内水体积和介质的体积。分离物质的大小，0Kav1，Kav=0或Kav=1，不能分离。常用介质：交联葡聚糖（SephadexG10—G200）；AmershamBiosciences交联琼脂糖（SepharoseCL-4B,CL-6B）SephacrylS系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）Superdex系列（高交联琼脂糖-葡聚糖）Bio-BeadsS-X系列（苯乙烯-二乙烯苯）Bio-GelP系列（聚丙烯酰胺）Bio-RadBio-GelA系列（琼脂糖）TSKgelSW系列（硅胶）TSKgelToyopearlHW系列，亲水性聚乙烯醇ToyoSodaTSKgelPW系列亲水性聚乙烯TSKgelCW-35纤维素Cellulofine纤维素Chisso操作程序：凝胶选择和处理（型号和粒度、凝胶用量、凝胶处理）凝胶柱的制备（柱选择，径长比约为1:25—1:100，装柱、柱鉴定），加样和洗脱（加样、洗脱、样品收集，检测）凝胶柱的再生和保存应用：分离纯化，脱盐和浓缩，去热源物质、分析检测（定性、定量、分子量）。（3）离子交换：电荷大小阳离子交换剂：，羧甲基（-O-CH2-COO-）阴离子交换剂：氨基乙级（-O(CH2)2-NH3+）•常用介质DEAE（二乙胺基以及）—CelluloseDE-23DEAE—CelluloseDE-52DEAE-SephadexA-50（25）DEAE-SepharosCL-6bDEAE-Bio-GelACM-CelluloseDE-52CM-CelluloseDE-32CM-SephadexC-25(50)•洗脱方式，梯度洗脱，线性和非线性洗脱•应用：物质分离、测定等电点（PI）01002003004005006007008009001000110012003004005006007008009001000020406080100Absorbance(mAU)Retention(ml)A280A380A480CNaCl(10-2mol/L)CondPeak1Peak2Peak34Peak567Peak8Peak9分离纯化洗脱曲线和紫外吸收光谱图3.A菌80%盐析浮质DEAE-52层析洗脱曲线图4.A菌不同盐浓度洗脱组分吸收光谱（a、b、c）。注：a、b、c中7个峰分别对应不同NaCl浓度，：峰3、4为0.05~0.10M洗脱组分，峰5、6、7为0.1~0.15M洗脱组分，峰8为0.15~0.2M洗脱组分，峰9为0.20~0.30M洗脱峰。峰8稀释6倍。3004005006007008009000.00.20.40.6AbsorbanceWavelength/nmPeak5Peak6Peak7b3004005006007008009000.00.20.40.60.81.01.21.4AbsorbanceWavelength/nmPeak8Peak9c3004005006007008009000.00.10.20.30.4AbsorbanceWavelength/nmPeak3Peak4a0204060800204060801001200246810Absorbance（mAU）Retention(ml)A280A380A480Cond（mS/cm）CondabcdebRetentiontime47.78minRetentionvolume38.167mLFlow0.8mL/min02040608010012002060801001201401600246810Absorbance（mAU）Retention(ml)A280A380A480abcCond（mS/cm）condaRetentiontime73.86minRetentionvolume36.916mLFlow0.5mL/min02040608010012002040601001502002503003500246810Absorbance(mAU)Retention(ml)A280A380A480abaRetentiontime74.30minRetentionvolume37.146mLFlow0.5mL/mincondCond（mS/cm）图7、8、9.分别为A菌Peak34、Peak7和Peak8组份分子筛层析结果。图7图8图9注：图均为280nm、380nm和480nm检测波长下的洗脱曲线，此外图中绿线代表盐浓度；图7中b为主要目标蛋白，图8中a为主要目标蛋白，图9中a为主要目标蛋白；图中标注各主要目标蛋白洗脱时间和洗脱体积，以及洗脱流速。A菌（4）疏水性相互作用色谱，利用疏水作用不同将蛋白质等大分子分离，利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水吸附剂为固定相，蛋白质等大分子与疏水吸附剂之间弱疏水作用的差异进行物质的分离。疏水吸附材料，含有苯基、辛基、丁基、醚基的吸附材料高盐溶液中吸附能力强，降低盐度将物质洗脱分离。成本高，实验室规模分离（5）反向色谱：利用表面非极性的介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，或极性有机溶剂（甲醇、乙腈等），进行物质分离的方法。特点是固定相表面完全被非极性基团覆盖，具有强的疏水性。介质：以硅胶为载体，经硅烷化连接C4、C8、C18烷基或苯基，常用C18硅烷化类别：制备型色谱和分析型色谱，应用：物质的分离和检测（定性和定量分析）10203040500100200H10H11H9H8H7H6H5H4H3H2Absorbance/mAURetentiontime/minH1反向C18层析柱液相色谱仪层析示意图样品：沼泽红假单胞菌（6）亲和层析固定相：特异性吸附材料，如酶抑制剂、抗原—抗体、A蛋白、配体—配基、过渡金属离子（Cu、Ni、Zn、Co等离子）与O、S、N等供电子基团形成