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蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4反应式为：2NH2+H2S04+2H＝（NH4）2S04（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为：（NH4）2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3＝（NH4）2B4O7+5H2O3.用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：（NH4）2B4O7+H2SO4+5H2O＝（NH4）2SO4+4H3BO3（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3消化根据样品量的多少选择适宜的凯氏烧瓶4个（此处以50毫升为例），其中2个为对照。向烧瓶内加入准确称量的样品，注意要把样品加至烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。另外2个作空白对照，好对样品进行校正。在每个烧瓶中加入约300毫克硫酸钾-硫酸铜混合物（硫酸钾：五水硫酸铜=3：1、6：1或10：1均可），再用量筒加入3毫升浓硫酸。将上述4个凯氏烧瓶放在通风良好处（最好在通风橱中进行）加热消化。先用小火加热至沸腾。此时会产生大量泡沫，应特别注意不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重影响分析结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调节到保持瓶内液体微微沸腾。假若发现瓶颈上有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液将其洗下。在消化过程中要时常转动烧瓶，使全部样品都浸在消化液中。当消化液呈清澈淡蓝色时即告消化结束。时间一般在5~6小时！若样品中含赖氨酸或组氨酸较多时，消化时间需要延长1~2倍。因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全。蒸馏采用改良式凯氏定氮仪。1、洗涤蒸馏仪：用硼酸指示剂（取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂约1毫升，摇匀后呈紫红色即可；混合指示剂：50毫升0.1%甲烯蓝乙醇+200毫升0.1%甲基红乙醇，存于棕色瓶中）检测是否清洗干净。干净标准：指示剂不变色。2、样品和空白的蒸馏：取2毫升稀释消化液至加样口加入反应室，关闭加样口，另取1个装硼酸指示剂的三角瓶接于冷凝管下端。取30%氢氧化钠（W/W）溶液约10毫升，从加样口缓慢加入，当未加完时关闭，并加入约3毫升蒸馏水，再继续缓慢加入一半后关闭，让剩下的水作液封。将加热器重新放在蒸汽发生器下加热（注：在清洗仪器完毕后应拿走加热器），待三角瓶中液体由紫红变成鲜绿色起开始计时，蒸馏5分钟，然后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1厘米，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外周，继续蒸馏1分钟。空白同样。3、清洗仪器：同上，不必用指示剂。滴定用0.0100mol/L标准盐酸（要标定，费时）滴定三角瓶中收集的氨，直至硼酸指示剂由绿变紫红。凯氏定氮仪原理及操作步骤凯氏定氮仪原理：蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成(NH4)2SO4反应式为：2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04(其中CuSO4做催化剂)2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O3.用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3凯氏定氮仪操作步骤：(一)消化1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液1.0mL，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g，浓硫酸2.0mL，30%过氧化氢1.0mL。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水1.0mL代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。(二)蒸馏和吸收蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。1、仪器的洗涤仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸气洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石(或毛细管等)，以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸气只能进入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷凝水。从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下换放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸没在溶液中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测样品使用。2、无机氮标准样品的蒸馏吸收由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，初学者宜先用无机氮标准样品进行反复练习，再进行有机氮未知样品的测定。常用巳知浓度的标准硫酸铵测试三次。取洁净的100mL锥形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基蓝-甲基红混合指示剂(呈紫红色)3～4滴，盖好瓶口待用。取其中一只锥形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶液中。注意：在此操作之前必须先打开收集器活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。准确吸取2mL硫酸铵标准液加到玻杯中，小心提起棒状玻塞使硫酸铵溶液慢慢流入蒸馏瓶中，用少量蒸馏水冲洗小玻杯3次，一并放人蒸馏瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10mL30％NaOH溶液，使碱液慢慢流入蒸馏瓶中，在碱液尚未完全流入时，将棒状玻塞盖紧。向小玻杯中加约5mL蒸馏水，再慢慢打开玻塞，使一半水流入蒸馏瓶，一半留在小玻杯中作水封。关闭收集器活塞，加热蒸气发生器，进行蒸馏。锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。自变色时起，再蒸馏3～5min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约lcm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏1min，移开锥形瓶，盖好，准备滴定。在一次蒸馏完毕后，移去煤气灯，夹紧蒸气发生器与收集器间的橡胶管，排除反应完毕的废液，用水冲洗小玻杯几次，并将废液排除。如此反复冲洗干净后，即可进行下一个样品的蒸馏。按以上方法用标准硫酸铵再做两次。另取2mL蒸馏水代替标准硫酸铵进行空白测定二次。将各次蒸馏的锥形瓶一起滴定。3、未知样品及空白的蒸馏吸收将消化好的蛋白样品三支，空白对照液三支，依次作蒸馏吸收。加5mL热的蒸馏水至消化好的样品或空白对照液中，通过小玻杯加到反应室中，再用热蒸馏水洗涤小玻杯3次，每次用水量约3mL，洗涤液一并倒入反应室内。其余操作按标准硫酸铵的蒸馏进行。由于消化液内硫酸钾浓度高而呈粘稠状，不易从凯氏烧瓶内倒出，必须加入热蒸馏水5mL稀释之，如果有结晶析出，必须微热溶解，趁热加入玻杯，使其流入反应室。此外，还应当注意趁仪器洗涤尚未完全冷却时立即加入样品或空白对照液，否则消化液通过冷却的管道容易析出结晶，造成堵塞。(三)凯氏定氮仪滴定样品和空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。打开接受瓶盖，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的标准盐酸溶液进行滴定。待滴至瓶内溶液呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。若振摇后复现绿色，应再小心滴入标准盐酸溶液半滴，振摇观察瓶内溶液颜色变化，暗灰色在一二分钟内不变，当视为到达滴定终点。若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定耗用的标准盐酸溶液用量中减去0.02mL，每组样品的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接受瓶内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以不滴定。记录每次滴定耗用标准盐酸溶液毫升数，供计算用。可以.凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法.即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收,再以标准碱滴定,就可计算出样品中的氮量.由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法.凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热,经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程,最后有机氮转变为无机氮硫酸铵,这一过程称为有机物的消化.为了加速和完全有机物质的分解,缩短消化时间,在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂,加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解,除硫酸钾外,也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点,但效果不如硫酸钾.硫酸铜起催化剂的作用.凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多,除硫酸铜外,还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等,但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素,应用最广泛的是硫酸铜.使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化.消化完成后,将消化液转入凯氏定氮仪反应室,加入过量的浓氢氧化钠,将NH4+转变成NH3,通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内,硼酸接受氨后,形成四硼酸铵,然后用标准盐酸滴定,直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度.滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数,通过计算即可得出总氮量.在滴定过程中,滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定.测定出的含氮量是样品的总氮量,其中包括有机氮和无机氮.硫酸铜与氢氧化钠先生成氢氧化铜浅蓝色,与过量氢氧化钠生成绛蓝色的铜酸钠深蓝色,铜酸钠不稳定见光分解成氧化铜黑色如果未变色或者颜色淡,那应该是加碱量不组,这种情况不能完全蒸馏出NH4,也滴定不出来或者结果偏小.建议如下操作:1检查NAOH浓度2检查设置加碱量3在蒸馏之前用空的消化管和锥形瓶运行2~3次过程