蛋白质组学研究内容和相关技术

一、什么是蛋白质组？与基因组差别？蛋白质组学的主要研究内容及技术体系？答：蛋白质组：Proteome，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由MarcWilkins在1994年提出的。基因组：Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。二者区别：蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域，它们之间既为互相补充又能互相帮助，但二者之间仍有一些区别：蛋白质组：多样性，无限性，动态性，空间性，互相作用。基因组：同一性，有限性，静态性，周期性，孤立性。蛋白质组学的主要研究内容：（1）表达蛋白质组学(expressionproteomics)：是对蛋白质组表达模式的研究，即检测细胞、组织中的蛋白质，建立蛋白质定量表达图谱，或扫描表达序列(EST)图谱。在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性，对寻找疾病诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究等具有重要作用。（2）细胞图谱蛋白质组学(cellmapproteomocis)：是对蛋白质组功能模式的研究，即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置和鉴定蛋白质复合物组成等，便于研究蛋白质在细胞内的行为、运输及蛋白质相互作用网络关系，它对确定蛋白质功能和疾病诊疗的靶位极有价值。蛋白质组学技术体系：（1）蛋白质组学分离技术，在整个蛋白质组学的研究中，分离技术是最基础的部分。如何实现对复杂的蛋白质样品或者其酶解产物进行有效的分离，是对样品做后续鉴定的先决条件。目前蛋白质组学常用的分离技术主要有两种类型，一是凝胶技术，主要包括双向凝胶电泳（2-DE）技术以及后来出现的双向荧光差异凝胶电泳技术（2D-DIGE）；二是非凝胶技术，主要是色谱(LC)技术，尤其是高效液相色谱（HPLC）和多维液相色谱（MDLC）。（2）蛋白质组学鉴定技术，在蛋白质组学研究流程中，蛋白质鉴定技术是最关键的部分。质谱技术在二十世纪初就已出现，但一直仅应用于有机小分子领域，直到八十年代才渐渐应用到生物大分子领域。经过二十多年来的应用和发展，质谱技术已是蛋白质组研究中必不可少的工具，并成为蛋白质组研究中的主要支撑技术。根据离子化源的不同，质谱主要可以分为电喷雾电离质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MS）两大类。（3）蛋白质组学定量技术，蛋白质组学的研究目的是以大规模的尺度研究细胞内蛋白质的功能，这种研究要走向成熟必然要脱离对蛋白质的简单鉴定，实现对蛋白质的表达水平及其变化的检测。因此，定量技术应该说是整个蛋白质组学的精华部分。而这种定量通常不必是检测蛋白质在细胞内的绝对含量，而只需对其相对含量进行定量即可。目前，蛋白质组研究中应用的比较成熟和可信的定量策略和方法主要有两种。一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量，另外一种是基于质谱检测技术的定量。（4）蛋白质组生物信息学，生物信息学（bioinformatics）是在生命科学、计算机科学和数学分析的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科，是运用数学与计算机科学手段进行生物数据等信息的收集、加工、存储、分析与解析的科学。随着蛋白质组学的不断发展，也对生物信息学提出了更多的挑战，两者不断的相互作用形成了蛋白质组生物信息学这一活跃的研究分支。二、什么是Cytokine？按功能可分为几类？答:Cytokine,即细胞因子。为了维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，防止肿瘤发生，机体的许多细胞，特别是免疫细胞合成和分泌许多种微量的多肽类因子，即细胞因子。它们在细胞之间传递信息，调节细胞的生理过程，提高机体的免疫力，在异常情况下也有可能引起发烧、炎症、休克等病理过程。按功能可分为以下几类：（1）白细胞介素（interleukin,IL)，由淋巴细胞、单核细胞或其它非单个核细胞产生的细胞因子；（2）集落刺激因子（colonystimulatingfactor,CSF)根据不同细胞因子刺激造血干细胞或分化不同阶段的造血细胞在半固体培养基中形成不同的细胞集落，分别命名为G（粒细胞）-CSF、M（巨噬细胞）-CSF、GM（粒细胞、巨噬细胞）-CSF、Multi（多重）-CSF（IL-3）、SCF、EPO等；（3）干扰素（interferon,IFN)根据干扰素产生的来源和结构不同，可分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ，他们分别由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞所产生；（4）肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF)根据其产生来源和结构不同，可分为TNF-α和TNF-β两类，前者由单核-巨噬细胞产生，后者由活化T细胞产生，又名淋巴毒素（lymphotoxin,LT)；（5）转化生长因子-β家族（transforminggrowthfactor-βfamily,TGF-βfamily)由多种细胞产生，主要包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGFβ1β2以及骨形成蛋白（BMP）等；（6）生长因子（growthfactor,GF）如表皮生长因子（EGF）、血小板衍生的生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子-I（IGF-1）、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子（LIF）、神经生长因子（NGF）、抑瘤素M（OSM）、血小板衍生的内皮细胞生长因子（PDECGF）、转化生长因子-α（TGF-α）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等；（7）趋化因子家族（chemokinefamily)包括四个亚族：（1）C-X-C/α亚族；（2）C-C/β亚族；（3）C型亚家族的代表有淋巴细胞趋化蛋白；（4）CX3C亚家族。三、简述Westernblot原理及步骤。Westernblot原理：经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Westernblot步骤：（1）试剂准备：SDS-PAGE试剂、匀浆缓冲液、转膜缓冲液、PBS、膜染色液、显色液；（2）蛋白样品制备：单层贴壁细胞总蛋白、组织中总蛋白或加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取；（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）；（4）转膜（如硝酸纤维素薄膜）；（5）免疫反应：封闭，用稀释过的一抗进行孵育，再用稀释过的二抗进行孵育。（6）显影；（7）凝胶图象分析。四、双向电泳原理。答：双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。第一向进行等电聚焦，蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS-PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。五、如何研究某一特定组织在病理状态的蛋白质组学变化，请简述其研究策略和基本技术。答：以肿瘤细胞的蛋白质组学研究为例，从免疫学的观点来看，肿瘤细胞属于异己细胞，肿瘤细胞会表达区别于正常细胞的肿瘤抗原，因而在患者血清中极有可能存在其相应的抗体。研究可分为四步：（1）首先采用2-DE分离肿瘤组织、癌旁正常组织的蛋白质；（2）与患者或正常人血清中的某一类免疫球蛋白建立Westernblot反应图谱，通过计算机分析确定差异反应的蛋白质斑点；（3）采用质谱分析和生物信息学方法对平行胶中相应的差异蛋白质点进行鉴定，筛选出肿瘤相关抗原；（4）用其他肿瘤组织和正常组织对肿瘤相关抗原的特异性进行分析。六、研究蛋白质相互作用的技术平台有哪些？试说明其中两项技术的基本原理（要求包括一项体外技术）。答：研究蛋白质相互作用的技术主要有：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）、酵母双杂交系统、Far-Western印迹技术、噬菌体展示技术、表面等离子体共振(SPR)、荧光共振能量转移(FRET)等。酵母双杂交的原理：将2个目的蛋白分别与AD和BD融合产生新的融合蛋白，如果这2个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使AD和BD互相靠近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。在这以前,也有许多生物化学方法用来研究蛋白质间相互作用,但都是在体外研究,该系统可以在酵母这种生长迅速且易操作的体系中研究真核细胞的蛋白质-蛋白质相互作用,且通过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质相互作用的蛋白基因。Far-Western印迹技术的原理：在Far-Western印迹中，运用经标记的或可被抗体检测的“诱饵”蛋白检测转移膜上的“猎物”靶蛋白。用SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）或非变性PAGE分离含有未知靶蛋白的样品（通常为细菌裂解液）然后转膜。靶蛋白附于转移膜表面时可以被检测到。转膜后，封闭膜，用一已知诱饵蛋白（通常用纯品）进行探测。诱饵蛋白与靶蛋白反应后，运用该诱饵蛋白的特异性检测系统即可检测出相应条带。七、试用所学的任一种蛋白质组研究方法解决自己课题中的一个科学问题？答：以中华绒螯蟹精巢中的ES-ERK蛋白为研究对象。（1）从成熟中华绒螯蟹精巢中提取总蛋白；（2）分光光度计确定蛋白浓度；（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；（4）以200mA120分钟电泳转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；（5）将膜用牛血清蛋白封闭，振荡器室温下振荡60min；（6）与稀释1：2000抗荧光-ERK1/2的抗体，在4℃下过夜。TBST5分钟洗涤膜三次，5min/每次，然后用山羊抗兔IgG缀合至辣根过氧化物酶（HRP，1：2000），在37℃进行1小时孵育；（7）用TBST洗涤三次之后，免疫反应蛋白带用ECL系统可视化之后，室温下将印迹在剥离缓冲液中洗涤15分钟，以去除结合的抗磷酸化抗体，然后再次用抗ERK1/2抗体（稀释1：1000）；（8）将印迹再次剥离并再次用兔抗β肌动蛋白的抗体探测。