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第一章蛋白质结构基础蛋白质工程：是以对蛋白质结构和功能关系的认识为依据，借助基因工程技术和X-射线衍射分析技术，从基因入手，通过定点突变改变核苷酸顺序，以达到改造现有蛋白质分子、或创造新的蛋白质分子目的的技术学科。蛋白质工程的程序：1.筛选纯化需要改造的目的蛋白，研究其特性常数等2.制备结晶，并通过氨基酸测序、X-晶体衍射分析、核磁共振分析研究，获得蛋白质结构和功能的相关数据。3.结合生物信息学的方法对蛋白质的改造进行分析4.由氨基酸序列及其化学结构预测蛋白质的空间结构，确定蛋白质结构和功能的关系，进而从中找到可以修饰的位点和可能的途径。5.根据氨基酸的序列设计核酸引物和探针，并从cDNA文库或基因文库中获取编码该蛋白的基因序列；6.在基因改造方案设计的基础上，对编码蛋白的基因序列进行改造并在不同的表达系统中表达；7.分离纯化表达产物，并对表达产物的结构和功能进行分析。蛋白质：是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，参与几乎所有的生命活动，与核酸共同构成了生命现象的主要物质基础，根据其形状、结构和溶解度的不同可以分为：纤维状蛋白质、球状蛋白质、膜蛋白。蛋白质的生物学功能1催化2结构成分3贮存4运动5转运6调节7信息传递8支架作用9防御和进攻中性：甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、缬氨酸Val、亮氨酸Leu异亮氨酸Ile含有羟基或硫：丝氨酸Ser、苏氨酸Thr半胱氨酸Cys脂肪族氨基酸：甲硫氨酸Met酸性：天冬氨酸Asp谷氨酸Glu天冬酰胺Asn谷氨酰胺Gln碱性：赖氨酸lys精氨酸Arg氨基酸芳香族：苯丙氨酸Phe酪氨酸Tyr色氨酸Trp（280nm吸收最多）杂环：组氨酸His脯氨酸Pro八种天然蛋白质：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸蛋白质结构：二级结构：一段连续的肽单位借助于氢键，排列成的具有周期性结构的构象。二级结构时多肽链主链局部区域的规则结构，它不涉及侧链的构像和与多肽链其他部分的关系。二级结构的类型:α-螺旋、β-折叠，回折、环肽链、无规则卷曲。超二级结构：相邻的二级结构单位组合在一起，彼此相互作用，行为规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中。结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质是三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。结构域的类型：全α结构域、全β结构域、α/β型结构域（max）三级结构的作用力：氢键、疏水键、盐键、范德华力。蛋白质的空间结构与功能的关系1蛋白质的空间构象是其功能活性的基础2蛋白质变性时由于空间结构的破坏，致使蛋白质生物功能的丧失3变性蛋白质在复性厚，构象复原，活性又能恢复维持蛋白质空间构象的作用力1疏水效应2氢键和范德华力3共价交联和离子相互作用4配位键影响蛋白质构象的因素有哪些？1）氨基酸侧链的疏水性：疏水氨基酸侧链集中在一起形成疏水核心,使肽链形成球形。2）范得华力：是万有引力的一种.分子中每一个原子与其它原子之间都有范得华力,维持着分子的稳定。3）偶极相互作用：由分子中带有极性基团的氨基酸引起,这种基团的电荷分布不均,使分子形成偶极相互作用,这是分子稳定的因素。4)静电相互作用：有些氨基酸带正电,有些带负电,电荷互相吸引或推斥,使分子形成特定构象5）氢键：有两类，链内氢键由同一条肽链不同部位的C=O和N-H基团形成；链间氢键是由不同肽链之间氨基酸侧链形成的。两种氢键对构象形成都起重要作用。6)熵效应：若蛋白质在油中溶解,其分子构象肯定与在水中的构象是不同。蛋白质的变性：天然蛋白质分子受到某些物理因素或者化学因素的影响时，会引起蛋白质天然构象的破坏，导致生物活性的降低或完全丧失的过程。实质是蛋白质分子中的次级键被破坏，引起天然构象解体，形成无规则卷曲的现象。蛋白质的复性：当变性因素除去后，变性蛋白又可以重新恢复到天然构象的现象。蛋白质体外再折叠过程和生理条件下蛋白质的生物合成及折叠具有相同的原理和途径。第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系。具有1简并性2多义性3全局性和复杂性等特点分子伴侣：是一类相互之间有关系的蛋白，他们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行非共价的组装。一类可介导蛋白质的正确折叠与装配，但并不构成被介导的蛋白质组分的蛋白。分子伴侣有下述功能：1帮助新翻译的蛋白的折叠2帮助蛋白质的跨膜转运3使一些聚合蛋白解聚4催化不稳定蛋白的降解5控制具有生物活性的调节蛋白的折叠，包裹转录因子从而调节基因的转录6参与系跑内囊泡的转运7参与细胞骨架蛋白的转配从而影响细胞的发育蛋白质的去折叠：蛋白质的去折叠和折叠为逆过程，当蛋白质变性后，就变成去折叠态。去折叠的方法有变性剂诱导、温度诱导、压力诱导等第二章蛋白质分子设计程序蛋白质的分子设计：就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。主要目的有两个：一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信；二是探索蛋白质的折叠机理。分子设计的分类：定点突变或化学修饰法拼接组装设计法从头设计全新蛋白蛋白质分子设计的原则：1活性设计2对专一性的设计3scaffold设计4疏水基团与亲水基团需合理分布5最优的氨基酸侧链几何排列蛋白质分子设计的程序：1收集相关蛋白质的结构信息：收集待研究蛋白质的一级结构、立体结构、功能结构域及与之相关的同源蛋白等相关的数据，为蛋白质分子设计提供依据和蓝本。2建立所究蛋白质的结构模型：PDB中或文献报道中有待研究蛋白质的三维结构，则直接采用作为分子设计的结构模型。3结构模型的生物信息分析：度所建立的有待研究的蛋白质的结构模型进行详细分析，分析确定其三维结构的特点功能区域以及分布、结构中存在的二硫键的数目与位置，为选择设计目标提供依据4选择设计目标；设计的第一步是选择目标，确定所要建造的三级结构，找出对所要求的性质有重要影响的位点或区域。5序列设计：选定目标之后就要进行序列设计，选择的序列尽可能的不同于天然结构的序列。设计时要充分考虑氨基酸残基的二级结构倾向性。6预测结果：当选择好氨基酸残基后，需要用理论预测法预测出所设计的多肽的二级结构和三级结构，初步检验设计的正确程度。7获得新蛋白质：对蛋白质进行计算机理论后，还要在实验室中付诸实现，以检验设计成功与否。8新蛋白质的检验9完成新蛋白质设计定位突变：指从基因水平上进行蛋白质分子的改造，即采用定位诱变的方法，对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入，删除，置换和改组，然后对突变后的基因进行蛋白表达并分析所表达蛋白质的功能活性。定点突变；蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码子决定的，只要改变其中一个或者两个碱基就可以改变氨基酸的种类，从而产生新的蛋白质。通常是改变功能区的某个氨基酸，以研究蛋白质的结构、稳定性和催化活性。试述定位突变有哪些种类？试述其基本方法。1定点突变：通过改变基因中的三联密码子中一个或两个碱基使氨基酸A变为氨基酸B2盒式突变：通过对三联密码子中一个位点上基因的修饰产生20种不同氨基酸的突变体，也就是由氨基酸A变为氨基酸X。定位突变的程序：1建立所研究蛋白质的结构模型2找出对所要求的性质有重要影响的位置3预测突变体的结构4构建突变体，获得突变体蛋白5突变体蛋白质的检验二级结构设计原则：设计α-螺旋时应该选择像Leu、Glu、Met等容易形成α-螺旋的残基，设计β结构时，应选择Val、Ile、pro、gly等残基，而在设计转角是常采用Pro-Asn。还要考虑二级结构中的相互作用力如疏水相互作用力，静电相互作用力。第三章蛋白质的修饰与表达蛋白质的化学修饰：作为生命活动物质基础的蛋白质的生物活性不仅取决于特定的一级结构，而且还取决于特定的空间结构。从广义上说，凡是通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生变化的过程称为蛋白质的化学修饰。蛋白质修饰的反应类型及修饰部位？蛋白质修饰的反应类型：烷基化反应、酰化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应。修饰部位：巯基的化学修饰（巯基最具亲核性）、氨基的的化学修饰、羧基的化学修饰、二硫键的化学修饰、其他侧链基团的修饰。亲和标记：亲和标记是一类位点转移性的化学修饰，试剂可以专一性的标记于酶的活性部位上，使酶不可逆的失活，因此又被称为专一性的不可逆抑制作用。重叠延伸PCR：（考试考大题，以作业作为参考）p77重叠延伸PCR技术由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起。该方法必须在特定的待突变位点和上下游分别设计引物，引物A、B为上下游引物，且分别与模板链互补，引物C、D为突变引物。先以引物B、C在一定条件下进行PCR，得产物BC，再以引物A、D进行PCR得产物AD，混合这两个扩增产物，以A、B为引物进行PCR，即可得到带突变点的DNA片段。将其装入特定的载体中，转化人相应的宿主菌，扩增后经鉴定得到目的DNA。蛋白质在大肠杆菌中表达（作业题第一题）原核表达载体需要哪些基本元件？复制起始点、选择性基因、启动子、核糖体结合位点、多克隆位点、转录终止序列T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流以Novagen公司的pET系统为杰出代表蛋白质在酵母菌中表达将编码异源蛋白的DNA序列克隆进含有酵母启动子和转录终止序列的表达框中转化及在宿主中稳定维持此DNA融合产物异源蛋白在特定培养条件下合成异源蛋白的纯化及其与天然产物的比较第5章结构解析1.X射线晶体结构分析基本原理：基本原理是X射线衍射现象，X射线衍射分析是利用X射线的破长和晶体中原子的大小及原子间距同级数量的特性来分析晶体结构。蛋白质晶体生长的影响因素：1温度2压力3外加物理场4PH5沉淀剂类型和浓度6溶液过饱和度7蛋白质纯度蛋白质结晶方法：1批量结晶法2透析法3液相扩散法4气相扩散法2.核磁共振法第六章数据库常用数据库：核算序列数据库和蛋白质组数据库蛋白质一次数据库：1.序列：SWISS-PROT、PIR2.结构：PDB、MMDB3.复合数据库：NRDB、OWL蛋白质二次数据库1.序列：PROSITE、PRINTS、Pfam结构：DSSP、HSSP、FSSP分类：Protomap核酸一次数据库：GenbankEMBLDDBJ第七章：蛋白质的分离与鉴定蛋白质的分离纯化方法（根据蛋白质的性质）理化性质①蛋白质的分子大小：透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的；②蛋白质的带电特性：，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是以此为依据来分离纯化蛋白质；③蛋白质的溶解特性：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离等均依据此原理④蛋白质的变性与复性：尿素变性复性⑤蛋白质的结晶：⑥蛋白质分子表面的特性：吸附层析⑦蛋白质的分子形状：亲和层析⑧蛋白质的紫外吸收：蛋白质中的芳香性氨基酸，主要是苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸（有最大吸收峰是因为有吲哚基团），它们的芳香侧链在紫外区域(200～300nm)具有较的紫外吸收，据此可以测定蛋白质含量；⑨蛋白质的颜色反应：具有特殊侧链的氨基酸残基与一些化学试剂反应呈现特定的颜色，如精氨酸胍基的坂口反应、酪氨酸酚羟基的米伦反应等。据此可以鉴定蛋白质的存在。蛋白质分离纯化与鉴定的步骤：1选择实验材料：通常情况下选择目标蛋白含量高，其他杂质少，容易获得、实验成本低。2实验材料的预处理：根据实验材料的不同，选择不同的实验预处理烦恼是方法。如果是液体材料通常采用过滤或离心的方法除去固体杂质即可获得粗制品。如果是固体材料则要经过洗涤破碎等方法。3蛋白质的提取：为了使蛋白质从实验材料中释放并分离出来，除了难溶蛋白其他的采用特定的缓冲液将蛋白质溶解，然后通过过滤或离心的方法去除，就得到了蛋白质的粗提取液。4蛋白质粗分级：利用简单的实验技术手段，对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化，经浓缩后得到蛋白质粗制品。5蛋白质细分级：采用分子筛层析、离子交换层析、亲和层析的手段结合电泳技