蛋白质药物的研究现状

蛋白质药物的研究现状郭世江20123762制药二班摘要：蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗；本文主要着重讲解多肽和基因工程药物。与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠，已成为医药产品中的重要组成部分。1982年美国Likky公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着第一个重组蛋白质药物的诞生。一种新型生物技术候选药物，它具有高效抗肿瘤、抗病毒功能。经中国药品生物制品标准化研究中心检测证实，其抗肿瘤活性较同类产品高246.7倍，抗病毒活性高10倍以上，可用于治疗多种恶性肿瘤和病毒感染性疾病。关键词：多肽，基因工程药物，单克隆抗体，基因工程抗体，重组疫苗，高活性，低毒性，抗肿瘤，抗病毒。Abstract:Polypeptideandproteindrugscanbedividedintogeneticengineeringdrugs,monoclonalantibodiesandgeneticallyengineeredantibodies,recombinantvaccine;papermainlyfocusesonexplainingpolypeptidesandgeneticengineeringdrugs.Comparedwithconventionalsmallmoleculedrugs,proteindrugswithhighactivityandspecificity,lowtoxicity,biologicalfeaturesaclear,beneficialcharacteristicsofclinicalapplications.Becauseofitslowcost,highsuccessrate,safeandreliablepharmaceuticalproductshasbecomeanimportantpart.1982UnitedStatesLikkycompanyfirstrecombinantinsulinmarket,markingthebirthofthefirstrecombinantproteindrugs.Anewbiotechdrugcandidates,itisanefficientanti-tumor,anti-viralfunction.BytheChinaResearchCenterofPharmaceuticalandBiologicalProductsStandardizationtestsconfirmedthattheanti-tumoractivityof246.7timeshigherthansimilarproducts,highantiviralactivitymorethan10times,canbeusedtotreatavarietyofmalignanciesandviralinfections.Keywords:Peptides,geneticengineeringdrugs,monoclonalantibodies,geneticallyengineeredantibodies,recombinantvaccine,highactivityandlowtoxicity,anti-tumor,anti-viral一、前言生物技术的发展促进了大分子生物活性物质的发现，用于治疗或诊断的多肽、蛋白质、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等药物不断出现，国外已批准上市的生物技术药物产品约90多种，进入临床实验的生物技术药品有369种，占美国临床实验药品的1/3，正在研究发展的大分子活性物质或药物达千种以上，生物技术药物的销售增长率在1998年到2004年每年增长12%～15％，生物技术药物已涉足于200多种疾病，其研究多数是针对癌症治疗，以及传染性疾病、神经性疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病、艾滋病、自体免疫性疾病、皮肤病等。早在上世纪90年代，美国FDA即已批准可以进行临床研究的基因疗法达72种，年初国家食品药品监督管理局也批准了重组人p53腺病毒注射液的生产。由于半衰期短，生物技术药物的基本剂型是冻干注射剂或注射液，需要长期频繁注射给药，面对生物大分子在稳定性及吸收等方面的困难，在研究和生产高质量的冻干粉针及溶液型注射剂的同时，发展多种途径给药的新剂型是制剂工业和研究的重要任务[1]。二、多肽药物主要包括多肽疫苗、抗肿瘤多肽、多肽导向药物、细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、诊断用多肽及其它药用小肽等7大类。1、多肽疫苗20世纪人们发明了疫苗，疫苗的出现有效地降低了人类传染病的发病率和死亡率。但传统疫苗是减毒或灭活病原体，存在一定的毒副作用。随着分子生物学和免疫学研究的快速发展，DNA疫苗、基因工程疫苗、抗体疫苗等一些新形式的疫苗不断出现。20世纪80年代Strohmaier等[2]发现口蹄疫病毒(FMDV)的146～154及200～213氨基酸肽段含有免疫性位点，从而找到了一种新型的疫苗，即肽疫苗。合成肽疫苗[3](syntheticpeptidevaccine)就是用化学合成抗原表位氨基酸序列法制备而成的具有保护性作用的类似天然抗原决定簇的多肽疫苗，这种疫苗不含核酸，是最为理想的安全新型疫苗，也是目前研制预防和控制感染性疾病和恶性肿瘤的新型疫苗的主要方向之一。多抗原肽(multipleantigenpeptide，MAP)是将病原微生物蛋白表面的多种T细胞或B细胞表位的氨基酸连接于树枝状的多聚赖氨酸骨架上而形成的一种具有独特三维空间结构的大分子疫苗。这种分子中含较多的抗原表位肽，不需载体蛋白就能对机体诱导出较高的免疫应答。这种设计方法使疫苗的一个分子中能够包含多种特异性的表位，能够很好地模拟表位构象，可诱导更好的保护力[4]。多抗原肽疫苗已经用于人免疫缺陷综合症病毒(HIV)、口蹄疫(FMDV)和疟原虫等多种病原的保护性抗原分析和疫苗的分子设计。美国科学家Bittll等按照O型口蹄疫病毒VP1的核苷酸序列合成了7种寡肽，将这些寡肽和钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，然后混合于弗氏完全佐剂中，制备成合成肽疫苗，能够产生足够的抗体，保护牛和猪不发病。该疫苗有B细胞表位(VP1环)和T细胞表位结合制备而成[5]，目前已经有将口蹄疫的O、A、C型口蹄疫病毒的保护性抗原决定簇偶联在同一载体上，研制成功多价合成肽疫苗；Patarroyo等[6]研制的复合多价45肽疫苗SPf66，是第一个成功的抗疟疾合成肽疫苗。脂肽疫苗(lipopeptidevaccines)是最近10多年来才开发出的一种多肽疫苗，它是将具有佐剂活性的脂质分子共价连接于抗原多肽链而制备成的。这种疫苗不需其它佐剂就能诱导机体产生广泛的免疫应答，而且没有佐剂的副作用，是一种很有应用前景的疫苗设计方法[7～9]。例如，用脂肽P3C(lipopeptidetripalmitoyl-S-glycerylcysteine,P3C)核心作为内源性佐剂，将蛋白的T细胞表位和B细胞表位与水溶性的脂肽P3C通过肟键连接制成四分枝的聚肟疫苗(polyoximevaccine)，在没有任何外源性佐剂的情况下即具有良好的免疫原性[10]。2、抗肿瘤多肽目前对肿瘤患者常见的化疗和放疗手段往往导致严重的副作用，因此寻找高效、低毒的抗肿瘤药物是目前的热点之一，而新型的多肽药物恰恰具备了这些特点。小分子多肽广泛存在于自然界，并可通过人工方法合成，由于其具有相对分子质量(Mr)小、活性高、毒性低的特点，在肿瘤的临床治疗上有重要的价值。肽类药物的资源数量巨大，利用提取、化学合成、噬菌体展示技术和蛋白酶降解可得到各种不同的肽[11]；1981年Rinehart等[12]首次从海鞘Trididemnumsolidum中分出并测定了环肽DidemninsA,B和C的结构，证实了它们具有抗肿瘤、抗病毒的活性，其中DidemninB的活性最强，既能抑制蛋白质的合成，也能抑制DNA、RNA的合成，对黑色素瘤Bl6细胞周期作用的研究表明，它可杀伤各种周期细胞，尤其是对G1至S期细胞敏感。人们又以合成、半合成或从其他海鞘中分离等多种方式得到了许多Didemnin的同系物。对多达42种Didemnin类化合物进行的结构与功能的对比研究表明，天然环肽核为其生物活性所必需，而对侧链的化学修饰则会明显地影响其活性强弱。如第二代Didemnin—脱氢DidemninB的体内外抗肿瘤活性比Didemnin强许多，目前脱氢DidemninB已进入临床研究；Kathleen等[13]人工合成了与ANUP的N端同源的2个多肽，A序列为：ELKCYTCKEPMTSASCRTIT，B序列为：pyroELKCYTCKEPMTSASCRTIT，裸鼠实验表明，它们对人宫颈癌细胞Hela的抑制率达到70%，鸡胚胎尿绒毛膜试验(chickchorioallantoicmembraneassay,CAM)结果表明，这2个多肽都具有抑制血管生成的作用。3、其他要用小多肽小肽药物除在上述几大方面已取得较大进展外，在其它很多领域也取得一些进展。比如Stiernberg等[14]发现一个合成肽(TP508)肽能促进伤口血管的再生，加速皮肤深度伤口的愈合。Pfister等[15]发现一个小肽(RTR)能防止碱损伤角膜内炎症细胞的侵润，抑制炎症反应。Carron等[16]证实其筛选的2个合成肽能抑制破骨细胞对骨质的重吸收。三、基因工程药物1、基因药物基因工程药物又称生物技术药物，是根据人们的愿望设计的基因，在体外剪切组合，并和载体DNA连接，然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞)[17]，使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质纯化及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。基因工程药物的本质是蛋白质，生产基因工程药物的方法是：将目的基因连接在载体上，然后将导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中的到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。若目的基因直接在人体组织靶细胞表达，就称为基因治疗[18]。利用基因工程技术生产药品的优点在于：大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽；挖掘更多的生理活性物质和多肽；改造内源生理活性物质；可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。2、基因前沿技术基因药物的直接体内基因治疗发展迅速，新型基因药物的不断产生。本文着重介绍对效果比较肯定关于基因药物的几项前沿技术，基因疫苗、反义RNA药物、三链DNA药物这三种新型基因药物技术的基本方法[19]。2.1基因疫苗2.1.1基因疫苗的免疫方法基因疫苗的免疫方法即基因疫苗的给药途径，目前使用的方法有以下几种：裸DNA直接注射：将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。脂质体包裹DNA直接注射：包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏。注射途径同裸DNA直接注射。金包被DNA基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞。繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法：选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其繁殖基因去掉，然后用质粒DNA转化细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA[20]。2.2反义RNA反义RNA指与mRNA互补后，能抑制与疾病发生直接相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达，具有特异性强、操作简单的特点，可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病。反义RNA治疗的基本方法有：反义寡核苷酸：体外合成十至几十个核苷酸的反义寡核苷酸或反义硫代磷酸酯寡核苷酸序列，用脂质体等将反义寡核苷酸导入体内靶细胞，然后反义寡核苷酸与相应mRNA特异性结合，从而阻断mRNA的翻译[21]。反义RNA表达载体：合成或PCR扩增获取反义RNA的DNA，将它克隆到表达载