蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析

1蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析摘要：生物活性肽(bioactivepeptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点InfluencingFactorsAnalysisofProteaseSpecificCleavageSitesAbstract:Bioactivepeptidesarefragmentswithspecificaminoacidsequencesthatexertapositivephysiologicalinfluenceonthebody.ManyreportedBioactivepeptidesareproducedbyenzymatichydrolysis,buttherearedisadvantagesofby-productandlowyield.Thechoiceofproteaseandproteinsourceisakeystep,andmanyfactorssuchaslocalconformation,tertiarystructure,experimentalconditionsandcausalinterferencecaninfluencetheproteasehydyolysis.Thisarticlepresentstheinfluencingfators,temperature,pHvalues,temperaturecombinedpHvaluesandmetalionsincluded,toprovidetheoreticalbasisforenzymaticlawanalysisandhigheryieldbioactivepeptidesproduction.Keywords:bioactivepeptides;protease;hydrolysisconditions;proteasecleavagesites1.前言生物活性肽(bioactivepeptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催产素、加压素、舒缓激肽、部分抗菌肽等，有的生物活性肽是以非活性的状态存在于某些蛋白质中，当用特定的蛋白酶水解后被释放出来，才成为有特定生理活性的肽。同种蛋白质经不同的蛋白酶酶解后，可以产生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、卵清白蛋白、牛乳蛋白、酪蛋白经不同的蛋白酶酶解可以产生具有降血压、抗氧化、防病、祛病、增强人体免疫力、促消化吸收等不同生理作用的肽[1]。由于生物活2性肽在药物、保健品等领域具有广阔的应用前景，因此对生物活性肽的研究与开发具有重要意义。2.生物活性肽的制备为了研究生物活性肽的结构与功能，开发相关药物或保健品等，需大量制备生物活性肽。目前，获得生物活性肽的主要途径有以下3种：①直接分离提取；②化学合成或重组DNA技术；③体外水解蛋白质[1]。天然生物活性肽分布很广泛，目前已经从动物、植物、微生物及部分海洋生物中直接分离出多种生物活性肽。天然生物活性肽通常具有高效、低毒、无污染等特点[2]。化学合成法有固相与液相两种方式，其基本原理几乎一样。化学合成法发展较早，也比较成熟。重组DNA法一旦建立好系统，就可以大量地重复性生产所要的活性肽。然而，这些制备方法存在一定的局限性。生物活性肽在生物体内的含量一般是微量的，如谷胱甘肽、催产素等，而且目前从天然生物体中分离纯化获得活性肽的工艺还不是很完善。化学法合成仍有许多缺点，包括①消旋化现象；②侧链官能团需要保护；③整体效率低；④使用大量的有毒溶剂，且成本高昂。因此化学合成法多半用在实验室，或是高价肽的生产上。重组DNA技术在基因的表达与产品回收上仍有问题，同时该法生产的活性肽种类也有限制，不能生产酰胺肽，也不适合制备短链肽[3]。酶法水解由于反应较温和、对蛋白质营养价值破坏小、使用的试剂毒性较低、反应具有空间立体性、产物没有消旋化现象、反应位点具有方向性、无异味等优越性，在现阶段被广泛用于制备生物活性肽。生物活性肽具有促进矿物质吸收、抑制细菌、抗高血压、抗氧化、抗疲劳、神经调节、免疫调节等生理活性，而这些功能是原蛋白质或其组成氨基酸不具备的，且许多活性肽的组成氨基酸不一定是必需氨基酸，选择合适蛋白酶水解把其有生物活性肽链片段释放出来，从而制备出具有各种各样生理功能的生物活性肽。这就为更充分的利用蛋白质资源，特别是为那些原本认为生物效价不高的蛋白质资源提供了新的机遇[4]。迄今，获得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白质水解酶和蛋白质的筛选以及酶解条件的优化上，通过改善水解工艺，进一步提高生物活性肽得率。随着生物信息学的发展及生物活性肽研究的不断深入，越来越多的蛋白质一级结构及活性肽的氨基酸序列得到阐明，免疫学的发展使得蛋白酶的酶切位点也越来越明3确，这为从原料蛋白质中寻找已知氨基酸组成序列的生物活性肽提供了基础。研究表明，具有特定生物活性的肽具有相似的结构特征，而其活性与肽的理化性质相关。因此，根据活性肽的氨基酸组成结构信息和不同蛋白酶的水解位点特异性可以利用计算机使用特定酶模拟定向的释放活性肽，如黎观红等（2003）利用Access数据库软件建立了一个生物活性肽数据库，利用自编程序可用来寻找蛋白质中潜在的生物活性肽从该蛋白质中释放出来的适宜的酶。陈征松等（2007）建立了活性肽搜寻与蛋白模拟水解数据库，实现了蛋白质用单酶或者复酶的模拟水解。VanessaVermeirssen等（2004）建立蛋白质数据库并进行了实验，取得初步成果。但酶法制备活性肽过程中一个具有挑战性的问题是，在蛋白质酶切过程中，会出现漏切位点和非专一性酶切位点，最终无法保证绝对把蛋白质酶切为常规的肽段，造成许多不必要的产物生成。这是利用蛋白酶催化合成活性肽最明显的副作用。对于常用的酶解来说，局部构象、三维结构、实验条件、酶切位点附近的其它氨基酸以及其它偶然因素都会影响蛋白水解酶的酶切效果[5]。因此，研究蛋白质的酶切位点的影响因素，分析蛋白质的酶切规律，对制备高纯度、高产率的目标活性肽以及进一步研究其活性与结构的关系，具有重要意义。3.蛋白酶和蛋白质的选择蛋白酶的选择是酶法制备活性肽的关键步骤。在酶的筛选过程中，应以原料蛋白的组成和酶的专一性为参考，也可根据目标活性肽的结构特点进行选择或通过酶工程来生产特定酶[6]。根据水解方式不同可将目前常用蛋白酶分为以下2类[7]：（1）内切酶：作用于蛋白质分子内部肽键。包括动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等；以及微生物来源蛋白酶，如丹麦Novo公司生产的碱性蛋白酶Alcalase、复合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase等。（2）外切酶：作用于蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，生成游离氨基酸，其中作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。外切酶的一个重要特性就是能够把处于肽链末端的疏水性氨基酸水解出来，降低多肽的苦味。常见的一些蛋白酶及其作用位点见表1。4表1常见蛋白酶的作用位点种类来源最适pH作用位点胃蛋白酶胃黏膜2~3Phe-，Leu-胰蛋白酶胰脏7~9Arg-，Lys-胰凝乳蛋白酶胰脏3.7Tyr-，Trp-，Phe-，Leu-木瓜蛋白酶木瓜果实5~7Arg-，Lys-，Phe-X菠萝蛋白酶菠萝果实5~7.5Lys-，Ala-，Tyr-，Gly-碱性蛋白酶Carlsber枯草杆菌6.5~8.5Ala-，Leu-，Val-，Tyr-，Phe-，Try-许多动物蛋白和植物蛋白都可作为的来源。部分活性肽来自乳蛋白、酪蛋白、乳清、鸡蛋和肌肉蛋白质等动物蛋白质。此外，海洋生物如鱼、鲑鱼、牡蛎、大型藻类、鱿鱼、海胆、虾、雪螃蟹、海马也可作为活性肽的蛋白质源。植物蛋白质常用的包括大豆、豆类（扁豆、鹰嘴豆、豌豆和豆类）、燕麦、小麦、火麻仁、油菜和亚麻籽。目前，选择用于制备活性肽的蛋白质应该基于2个标准[8]：（1）使用未充分利用能够进一步增值且蛋白质含量丰富的食品工业副产物；（2）含有特定氨基酸序列或特定药理氨基酸残基的蛋白质。蛋白质的合理选择，对提高目标肽的产率至关重要。4.酶切位点的影响因素分析4.1.温度对酶切位点的影响4.1.1.对专一性酶切位点的影响一般情况下，蛋白酶在最适温度时酶切速率最大，偏离最适温度时活性降低。温度变化影响蛋白质的空间结构，从而影响了其对蛋白酶的亲和力。例如温度升高时，蛋白质底物中更多的酶切位点暴露出来，酶切更容易进行。研究发现，随着温度升高，蛋白质中更多的专一性酶切位点被水解，水解范围更广泛。SeroneiCheluleiCheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25℃、37.5℃、和50℃）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白模式的影响[9]。一般情况5下，胰蛋白酶为肽链内切酶，水解赖氨酸或精氨酸的羧基与其它氨基酸（脯氨酸除外）形成的肽键。结果发现，随着温度升高，更多的赖氨酸残基和精氨酸残基被水解。在pH7.8和50℃的条件下水解10分钟之后，所有可能的专一性酶切位点都被水解。因为脯氨酸能影响蛋白酶水解肽键，所以Lys47-Pro48未被水解。在25℃，只有β-乳球蛋白的末端区域被酶解，然而，随着温度升高，β-乳球蛋白中心区域也开始被水解。BlancaHern´andez-Ledesma（2006）将牛的β-乳球蛋白A（β-LgA）在非变性和变性加热条件下用嗜热菌蛋白酶水解，用HPLC-MS/MS确定水解过程中释放的肽段[10]。一般情况下，嗜热菌蛋白酶水解疏水性或芳香族氨基酸的氨基端肽键，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在37℃反应5分钟后，总共确定了水解产物中的25个肽段，这些肽段一直到更高的保温温度时才进一步水解。此外，在60℃和80℃之间的范围内发现了新的酶切位点，这些酶切位点位于β-乳球蛋白的最深埋区域。在60℃和80之间的范围内水解30分钟后所得产物中发现了三个新的肽段：LDA、LKPTPEGD、LQKW，相关的位点为Leu122-Val123、Glu127-Val128、Ala132-Leu133。但它们在37℃和50℃30分钟水解物并没有发现。其中的LQKW据报道是一种高效ACE抑制剂。温度变化引起了β-乳球蛋白构象的变化，使得这些肽键更容易被嗜热菌蛋白酶水解。提高酶解温度到60℃以上，可在更短保温时间内释放出肽段LQKW。4.1.2.对非专一性酶切位点的影响随着温度升高，更多的酶切位点暴露出来，在加强专一性酶切的同时，也较易出现非专一性酶切现象。SeroneiCheluleiCheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25℃，37.5℃，和50℃）结合不同的碱性pH值（7.8，8.65，9.5）对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白模式的影响[9]。结果发现，水解环境也影响非特异性裂解，在较高温度（50℃）下更容易出现胰凝乳酶式的酶切。胰凝乳蛋白酶，和胰蛋白酶一样是消化道的丝氨酸蛋白酶。它催化的羧基端侧的肽键水解的酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，其中都含有一个与疏水腔相匹配的芳环。此外，它也能水解亮氨酸的羧基端。此外，二次水解胰凝乳蛋白酶能水解蛋氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸和丙氨酸的羧6基端。新出现的酶切位点为Leu10-Asp11、Gly17-Thr18、Ser21-Leu22、S