蛋白酶产生菌的分离

蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。1实验材料1.1实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（pH5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。2实验方法与步骤2.1培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃，15-20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。7．制作平板将灭菌后的培养基冷凝至55~60℃,放在超净台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，以铺满皿底为度。8．无菌检查待培养基凝固后，5个培养皿一叠，倒置平放在恒温培养箱中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。2.2蛋白酶产生菌的分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80℃水浴中热处理10min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32℃培养24-48h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。2.3蛋白酶产生菌的筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32℃培养24-48h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。2.4蛋白酶产生菌的选育2.4.1紫外线对出发菌株的诱变效应1）菌悬液的制备：①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。②将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。③用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板27套，凝固后待用。3）紫外线处理：①将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。②取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖，关闭紫外灯。4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。5）涂平板：取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。6）培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。7）计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。8）观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。2.5蛋白酶产生菌的发酵与酶活力测定2.5.1蛋白酶产生菌的发酵（1）将保藏培养基中的产蛋白酶芽孢杆菌接种两环到种子培养液中，30-32℃摇床发酵培养16h,4℃冰箱保存。（2）取10ml含产蛋白酶芽孢杆菌的种子培养液接入含100ml酪素液体发酵培养基的250ml三角瓶中，30-32℃摇床发酵培养，作为样一。（3）样一培养12h后，再取10ml含产蛋白酶芽孢杆菌的种子培养液接入含100ml酪素液体发酵培养基的250ml三角瓶中，30-32℃摇床发酵培养，作为样二。（4）在发酵培养的48h内，每3h取一次样，每次取5ml,放入10ml的离心管中，于4℃冰箱冷藏。（5）48h后将所有取样3000rpm离心10min，离心所得上清液680nm进行酶活力测定，每管沉淀加5ml蒸馏水600nm测生长曲线。2.5.2试剂和溶液2.5.2.1福林试剂2.5.2.2碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL.2.5.2.3三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL。2.5.2.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。2.5.2.5盐酸溶液c(HCI)=lmol/L及0.lmol/L按GB601配制。2.5.2.6缓冲溶液a磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5g，加水溶解并定容至I000mL2.5.2.710g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.00lg，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。2.5.2.8l00µg/mLL-酪氨酸标准溶液a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用lmol/L盐酸60mL溶解后定容至l00mL，即为lmg/mL酪氨酸标准溶液。b.吸取lmg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到l00µg/mLL一酩氨酸标准溶液。2.5.3分析步骤2.5.3.1L-酪氨酸标准曲线的绘制a.L-酪氨酸标准溶液的配制：管号酪氨酸标准溶液的浓度µg/ml取100µg/mlL-酪氨酸标准溶液的体积取水的体积ml000101101922028330374404655055b.分别取上述落液各1.00mL(做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL,福林试剂使用溶液1.00mL，置于40℃士0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(µg)，即为吸光常数K值。2.5.4酶活力的测定a.先将酪素溶液放人40'C士2'C恒温水浴中，预热5minb.按下列程序操作:步骤试管A(空白)试管B(酶试样，做3个平行试样)1加酶液1.00ml（离心上清液）加酶液1.00ml（离心上清液）240℃±0.2℃,水浴2min40℃±0.2℃,水浴2min3加三氯乙酸2.00ml(摇匀)加酪素1.00ml(摇匀)440℃±0.2℃,10min40℃±0.2℃,10min5加酪素1.00ml(摇匀)加三氯乙酸2.00ml(摇匀)6取出静止10min,过滤取出静止10min,过滤7取1.00ml滤液取1.00ml滤液8加碳酸钠溶液5.0ml加碳酸钠溶液5.0ml9加福林试剂使用液1.00ml加福林试剂使用液1.00ml1040℃±0.2℃,显色20min40℃±0.2℃,显色20min11于680nm波长测其吸光度于680nm波长测其吸光度2.5.4.2计算X=A*K*4/10*n=2/5*A*K*n式中:X一一样品的醉活力，u/g(u/mL)tA一一样品平行试验的平均吸光度;K—一吸光常数;4—一反应试剂的总体积,mL10一一反应时间10min，以lmin计;n一一稀释倍数。所得结果表示至整数。2.6培养基优化（正交实验）正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。正交试验设计的基本特点是：用部分试验来代替全面试验，通过对部分试验结果的分析，了解全面试验的情况。正因为正交试验是用部分试验来代替全面试验的，它不可能像全面试验那样对各因素效应、交互作用一一分析；当交互作用存在时，有可能出现交互作用的混杂。虽然正交试验设计有上述不足，但它能通过部分试验找到最优水平组合，因而很受实际工作者青睐。例如下表为一培养基优化的4因素3水平简表4因素3水平表2.7产蛋白酶菌生长曲线的测定2.7.1获取不同培养时间发酵液2.7.1.1整点8:00时，准时接入已经活化好的对数期菌种，用1000ul的移液枪吸取5ml的对数期菌液加入到发酵瓶A中（液体为酪素培养基），剩下的对数期菌种菌液置于4℃冰箱种中保藏于。并同时将A号发酵瓶放到摇床中，继续30℃震荡发酵。在直到20:00时将放在冰箱中保藏的菌种液（活化的对数期菌种）取出5ml接种到B号发酵瓶中。并放在30℃的摇床中继续发酵。2.7.1.2在8：00时，将放在冰箱中保藏的菌种液（活化的对数期菌种）取出5ml接种到C号发酵瓶中。立即从A、B、C号瓶移取发酵液5ml到对应的离心管中。A瓶取样分别对应的编号是12、13、14、15、16、17、18对应培养时间为24h、26h、28h、30h、32h、34h、因素水平蔗糖（%）NH4NO3（%）KH2PO4（%）MgSO4·7H2O（%）ABCD1100.10.050.12150.20.10.253200.30.30.536h。B瓶取样分别对应的编号是6、7、8、9、10、11对应培养时间为12h、14h、16h、18h、20h、20h完成全部取样。C瓶取样分别对应的编号是0、1、2、3、4、5对应培养时间为0h、2h、4h、6h、8h、10h。并且全部放到4℃冰箱封存。2.7.2吸光度值的测定将编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18的离心管从冰箱里取出，用离心机在设定的转速为3500rpm,离心10min,将要测酶活力的的编号的上清液倒入另一干净的试管中。沉淀留下。（2）离心管中加入蒸馏水5ml轻微震荡制成悬