血栓与止血检验进展王鸿利

1血栓与止血检测进展王鸿利上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海血液学研究所，2000252近年，随着基础理论和实验技术的发展，血栓和止血检验及其临床应用也有了很大的进展，本文就此作一简述。3（一）血小板微颗粒检测血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以伪足断裂方式形成直径为0.1～1.0µm的血小板颗粒（PlateletMicroparticle,PMP)。PMP的体积较正常血小板小，但有完整的血小板膜结构和功能。PMP膜上可表达多种血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）、GPⅠb/Ⅸ-Ⅴ、血小板活化因子（PAF）、β-样前体淀粉蛋白、Ca2+依赖性蛋白酶Calpainyi以及有促凝作用的磷脂等。因此检测血循环中的PMP可较完整地反映血小板参与血栓形成和血液凝固的功能。45〔检测方法〕流式细胞术。主要试剂为CD61parcp:多甲藻素-叶绿素蛋白标记抗血小板GPⅢa的单克隆抗体〔参考值〕66±17个/104血小板（山东大学齐鲁医院报道）。6〔临床意义〕PMP主要用于动脉血栓性疾病的检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标志物。1.急性冠脉综合征（ACS）：有证据显示，PMP参与动脉粥样硬化和血管再梗塞的病理过程。Cawaz等对急性心肌梗死（AMI）施行PTCA患者进行系列血小板功能研究，发现PTCA术后患者的血小板数因消耗增加而减少，PMP因大量形成而增多，后者又参与冠脉血栓的形成。Katopodis等对行冠脉血栓形成术的ACS患者进行观察，他们将血小板激活状态作为试验组（近期发生AMI、不稳定性心绞痛者），结果发现，试验组患者PMP水平较正常对照组明显增高。72.脑血栓形成：对大血管血栓、小血管血栓、多发性脑梗死和阿尔茨海默病患者进行PMP检测。结果发现，阿尔茨海默病患者的PMP水平与正常对照组无统计学差异，而其他疾病组患者的PMP水平均显著高于正常对照组，且治疗后有明显的降低，而且小血管血栓组患者的PMP水平高于大血管血栓组患者。表明PMP水平的增高，主要反映小动脉的血栓形成和血栓阻塞。8（二）血小板-白细胞聚集体检测血小板被激活后，血小板释放P-选择素（P-selectin或GMP-140）。P-选择素与白细胞和（或）单核细胞膜上的P-选择素配体糖蛋白-1（PSLG-1）结合形成血小板-白细胞聚集物（Platelet-LeucocyteAggre-gate,PLA)和（或）血小板-单核细胞聚集物（Platelet-Monocyte–Aggregate）。该聚集体是反映动脉血栓形成的特异性标志物之一。9〔检测方法〕流式细胞术。主要试剂为FTTC标记的鼠抗人GPIb（CD42b）单克隆抗体，藻红蛋白标记的抗人白细胞CD45单克隆抗体，FTTC标记的鼠抗人P-selectin（CD62b）单克隆抗体。〔参考值〕瑞典学者报道血小板-白细胞聚集物为15.3±8.5％（PLA/L）。10〔临床意义〕动物实验和临床研究表明，PLA是更敏感和更特异的血栓标志物。一组93例胸痛患者，其中9例为AMI患者，其血小板-单核细胞聚集物为34.2±10.3％，84例非AMI胸痛患者的血小板-单核细胞聚集体为19.3±1.4％，二组差异显著（Ｐ＜0.05）；AMI胸痛组和非AMI胸痛组患者的血小板-单核细胞聚集物水平均较10例正常对照组的血小板-单核细胞聚集物水平为高（Ｐ＜0.001）。11（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管性血友病因子（vonWillebrandFactor,vWF）主要受vWF裂解蛋白酶（vWFC-leavingProteinase,vWF-CP）的调节。vWF–CP作用于vWF分子量为250000多聚体的Try（842）-Met（843）之间的肽键，将它们水解成分子量为176000和140000的两个小分子肽段。此时vWF不能过度地参与血小板的粘附和聚集，因此vWF–CP是限制血栓形成的标志物之一。121314〔检测方法〕ELISA。以Ⅲ型胶原包被酶标板，2.5％BSA封闭，分别加入未透析的标本和经Slide-A-Lyzer透析过的标本，一抗为兔抗人vWF多抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，加入底物OPD490nm显色。结果以透析前后的OPD490比值作为该份标本的残余胶原结合活性（vWF:CBA或R-CBA）表示，R-CBA越高，vWF-CP活性越低。〔参考值〕83例正常人①血浆（n﹦30）vWF:CBA范围为2.1％～40.5％（21.9±9.2％）；②血清（n﹦53）vWF:CBA范围为2.4％～52.0％（20.5±10.8％）（苏州大学附一院）。15〔临床意义〕1.血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：由于患者的vWF-CP基因缺陷或患者血浆中存在抗vWF-CP自身抗体，使vWF-CP血浆水平显著降低，不能正常裂解超大分子量的vWF多聚体（UL-vWF）。体内聚集的UL-vWF易于血小板结合，促使血小板粘附和聚集，引起TTP病理过程的发生和发展。一组5例TTP患者检测vWF:CBA结果为48.1％～96.5％（78.2±20.2％），较正常对照组明显增高，反映患者vWF-CP明显降低。162.血管性血友病（vWD）：据报道，21例vWF患者血浆vWF:CBA水平明显降于30例正常人、15例血友病患者及30例其他出血性疾病患者（Ｐ＜0.001）。在vWF中，Ⅰ型患者的vWF:Ag/vWF:CBA比值≈1.0；Ⅱ型患者的vWF:Ag/vWF:CBA比值＞2.0；Ⅲ型患者的vWF:Ag/vWF:CBA都极低，其vWF:Ag/vWF:CBA比值具有可变性。173.恶性肿瘤：恶性肿瘤患者的vWF-CP活性水平显著低于正常人，伴有远处转移患者的vWF-CP活性水平更低，接受手术治疗后患者的vWF-CP可升高，导致血浆大分子多聚体增多，促使vWF参与血小板粘附和聚集，加剧恶性肿瘤患者的高凝集状态和血栓形成，反映vWF是参与恶性肿瘤血栓形成机制之一。18(四)单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测（monoclonalantibodyspecificimmobili-zationofplateletantigen,MAIPA）将待测抗体、单抗和血小板共同温育，得到血小板膜GP、待测标本和单抗三分子复合物，然后加入酶联抗体并以微粒色被抗体固化于微孔中显色，显色深浅与待测抗体水平呈正比。〔参考值〕抗GPⅡb/Ⅲa阳性，A值＞0.133；抗GPⅠb阳性，A值＞0.2091920〔临床意义〕检测血小板相关抗体，其敏感度和特异度高于双抗体夹心ELISA法。用于检测ITP和同种免疫血小板减少症。21两种方法对ITP诊断的比较ELISA法MAIPA法PAIgGPAIgAPAIgMGPⅡb/ⅢaGPⅠb阳性率（％）8127225413敏感性（％）8866607566特异性（％）5075768394诊断效率（％）722722731322(五)凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）检测凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物（T-TM）将由肝脏合成的、分子量为55KD的凝血酶激活的纤溶抑制物（ThrombinActivatableFibrinolysisInhibitor,TAFI）的Arg（92）-Ala（93）之间的肽键水解后，脱去一个活化肽，TAFI变成活化型的TAFIa。TAFI具有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性，但是TAFI也受蛋白C抑制物（PCI）的抑制。2324〔检测方法〕采用ELISA测定TAFI：Ag。以鼠抗人TAFI单克隆抗体包被酶标板，加入标准品或样品后，再加入辣根过氧化物酶标记的抗人TAFI抗体，充分作用后加入邻苯二胺使之显色，显色深浅与样本TAFI的含量成正比。TAFI:A采用发色底物法测定。〔参考值〕TAFI:Ag（n﹦34）为77％±28％（21～133％）；TAFI:A（n﹦34）为24±5µg/L（14～34µg/L）（上海瑞金医院）25〔临床意义〕1.深静脉血栓（DVT）：Tiburg等对脑74例初发DVT患者的TAFI:Ag进行检测，发现其水平增高。口服避孕药的正常生育期妇女，若TAFI：Ag水平超过90％，其水平的危险性水平2倍，此时患者的纤溶活性减低。2.动脉血栓（冠心病）：瑞金医院对19例冠心病患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现冠心病患者的TAFI:Ag和TAFI:A的水平均高于正常对照组（Ｐ＜0.001），与Silveira报道11例冠心病的检测结果一致，表明患者的纤溶活性明显降低。此外，TAFI水平增高也见于不稳定性心绞痛。263.微血栓（DIC）：瑞金医院对15例DIC患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现患者的水平明显低于正常对照组（Ｐ＜0.001），表明患者纤溶活性明显升高。4.其他：TAFI水平升高还见于感染、因子VLeiden突变；TAFI水平减低还见于某些凝血因子缺乏（血友病、FⅪ缺乏症）、急性早幼粒细胞白血病（TAFI:A减低66％，但TAFI:Ag正常）。27（六）可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（SolubleEndothelialProteinCReceptoe,sEPCR）是由血管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连EPCR，一部分流离于血浆称sEPCR。克隆的膜连EPCRcDNA全长1.3kb,是一种由221个氨基酸组成跨膜糖蛋白。膜连EPCR通过促进T-TM复合物与蛋白C（PC）的结合，进而放大PC的活性；此外，EPCR还对体内急性炎症反应河DIC的发生具有保护作用。然而，血浆中sEPCR与膜连的EPCR具有相反的作用。sEPCR也可与PC和活化蛋白C（APC）结合。抑制PC的活化和抑制APC的抗凝活性，减轻膜连EPCR的增强PC活化和APC的抗凝作用，所以血浆sEPCR水平的增高市反映血管损伤和抗APC抗凝作用的特异性标志物。28〔检测方法〕采用ELISA。以单克隆-抗包被酶标板，分别加入血浆标本和不同稀释度的sEPCR标准品后，以生物素标记的单克隆二抗作为检测抗体，加入底物后显色，绘制标准曲线。〔参考值〕血浆sEPCR为115.2±20.7µg/L29〔临床意义〕安徽省立医院报道的结果见表1组别nsEPCR（µg/L）Ｐ值正常对照值20115.20±20.70冠心病组30134.20±69.60心绞痛17148.90±87.90心肌梗死8117.60±33.80糖尿病组56177.00±81.40＜0.001败血症组30172.60±43.70＜0.001SLE合并血栓组14144.70±33.90＜0.005SLE血栓组49165.80±45.30＜0.00130（七）蛋白CGlobal试验凝血酶（T）与血管内皮细胞的凝血酶调节蛋白（TM）形成复合物（T-TM），后者使PC转化为APC。APC在蛋白S（PS）的辅助下，灭活因子Va和因子Ⅷa，还抑制纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1），使纤溶活性增强。然而，Agkistrodoncontorix蛇毒可以取代T-TM复合物直接激活PC，使PC转化为APC，APC也受PAI的抑制。31〔检测方法〕在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活PC，使PC转化为AP-C。随后在检测系统中加入APTT试剂以检测依赖PC活性的血浆凝固时间（ProteinCActiv-ItyDependentClottingTime,PCAT）若待测血浆中的PC系统正常，则加入Ca2+后血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的影响，本试验设计了对照组，即在实验过程中以缓冲液代替PC激活剂，血浆不依赖PC活性的血浆凝固时（PCAT/O），其结果应短于60s。32〔参考值〕PCAT为85～200s，PCAT/O为33～55s（n﹦234）。〔临床意义〕本试验对PC活性低于参考值70％的检出率为90％；对PS活性低于参考值的60％的检出率为89％；对凝血因子ⅤLeiden突变的检出率为100％；对凝血酶原（FⅡ）20210C→A突变的检出率为84％。本试验的