血液T细胞的分化

血液T细胞的分化：人类诱导多能干细胞重编程成神经细胞摘要：背景：人类诱导多能干细胞在形态与功能上类似于人类胚胎干细胞，其为疾病模型和药物筛选提供了使用病人特异性体细胞的机会。为了进一步接近临床应用、通过一些侵害性较少的方法和易获得的组织形成ipscs是很重要的，其中包括了外周血液。与此同时，怎么将来源于血液T细胞的ipscs分化成神经样细胞的方法仍然是不清楚的。方法：我们利用基于EBNA1附着型载体，其是一个在饲养层培养和无饲养层培养的情况下可以将体细胞重编程成ipscs的无病毒系统，其T细胞经电穿孔形成ipscs然后诱导其成为神经细胞。结果:我们成功地从捐赠者的20ml外周血中分离出了足够的T细胞并在四周内重新编程这些T细胞成ipscs。这些ipscs可以稳定的传代至少50代，并且展示出了多潜能和多向分化的能力。尤其是在21天的诱导培养下，这些来源于T细胞的ipscs可以分化成神经巢蛋白，GFAP和在免疫荧光法下检测到的MAP2阳性细胞。结论：我们用更安全的方法将成人体细胞形成无外源整合基因和无病毒人类ipscs。这种诱导法对人类无外源整合基因的来源有用。并且在不久的将来，可以为了药物筛选和治疗来应用来源于ipscs的神经细胞。关键词：电穿孔法；EBNA1；IPSCS；无病毒诱导多能干细胞；T细胞1.介绍重新编程人类分化细胞为ipscs，其在使用有完整基因匹配的病人特异性细胞及疾病模型，病理生理学的研究，药物筛选和细胞基础治疗学的完整基因匹配方面强有力的提供了新的展望。自2007年以来、通过病毒载体表达的确定的重编程因子的诱导，很多种类的体细胞都可以形成ipscs。基因整合型病毒载体可能会引起插入式突变或者更有甚者会增加形成肿瘤的风险。在几起基因治疗中悲剧性的演示后，病毒载体的使用在临床应用安全的方面引起了广泛的注意。为了解决这些问题，找到了很多可替代的选择、如非病毒和无外源基因整合的方法都更具有安全性。在最近的报道中的无整合质粒的电穿孔、小分子调节器、重组蛋白、微环DNA载体和合成信使MRNA等。到目前为止，成纤维细胞仍然是在形成ipscs时最常用的细胞。但由于侵害性的皮肤活检和从原生组到建立稳定的细胞系时所耗费的时间的问题，其仍然在大规模的临床应用上作为一个未达最高标准的细胞。相较于皮肤成纤维细胞而言，血液单核细胞生成的人类ipscs，因其更多的适用性、更少的侵害性和细胞重编程的无限资源而被人们广泛的接受。一般而言，从皮肤活检到细胞原代培养会花费几周的时间。此外，大量冻存的血液细胞样本储存在了世界生物资源库，许多的研究部已成功地从人类未成熟的MNCS表达特异性标志物来形成ipscs。如CD34等。未成熟的MNCS是从Oct4,Sox2,C-Myc和Klf4转染的或是以少数逆转录方法重编程的脐带血，外周血和骨髓当中分离出来的。由于T细胞是外周血MNCS中最丰富的细胞，Seklietal分离了PBMNCS，并用抗CD3抗体和白细胞介素刺激了T细胞的扩张。然而，这些形成ipscs的方法的效率都很低，并且重编程因子会编码致癌基因，如原癌基因。最近来说，EBNA1附着体质粒是一种得到无整合ipscs的方法，这个方法可以允许重编程因子的修饰，使相关性变高并且使重编程因子长久表达。许多研究都名师出了一个较广的范围。其供体细胞，基因运载工具和重编程因子的组合都可用于形成ipcsc。在他们中间，最低的侵害性和最高的安全性的方法可提供有效的实际优势去形成人类ipscs。在这项研究中，我们从供体细胞中分离出了T细胞，随后将获得的T细胞重新编程成ipscs。经电穿孔法，使用无外源基因整合的EBNA1附着型载体将成年人类的血液T细胞重新编程成ipscs。重要的是，这些ipscs在21天的基础诱导下分化成神经细胞，T细胞来源的ipscs为没有病毒的无外源整合的ipscs提供了一个供选择的细胞来源的策略。显而易见的，从T细胞来源的ipscs分化而来的神经元细胞被用作为一个为了调查疾病原理的可扩展平台，在不久的将来，其可以为神经退行性变进行体外筛选和治疗。2.方法2.1T细胞的分离我们的这项研究是按照赫尔辛基宣言来实施的。外周血单核细胞是从六个捐赠者分离出来的，并且可知这六个捐赠者是根据机构审查委员会的指导方针来进行书面知情同意的，并且我们的这项研究已经被机构审查委员会批准。在我们的数据审查中，病人的记录都是已故前的。先将分层液至于试管底层，然后将一定比例的血液样本小心的进行分层处理（400g,30分，20度），收获淋巴细胞、单核细胞及血小板。然后用磷酸缓冲液冲洗两次，后再有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%V/v的胎牛血清中培养。2.2T细胞的刺激T细胞在新配制的无血清培养基中培养扩增，其中增补的有青霉素/链霉素/谷氨酸盐，及300IU/mlrhIL2和10ng/ml的可溶的抗CD3抗体。2.3人类ipscs的形成和培养形成无外源基因整合的的ipscs，用Amax-aTM人类T细胞NucleofectionTMKit将3μg表达质粒的混合物转入T细胞中。在每个核转染中，2×106细胞的T细胞都被0.83μpCXIE-hOCT3/4-shp53,0.83μgpCXLE-hsk,0.83μgpCXLE-hUL,和0.5μgpCWB-EBNA1处理（质粒都是从Addge获得的）。接下来进行细胞培养，新复苏灭活的MEFs饲养层细胞会被添加到每个孔（培养10-14天）。ALP阳性ipscs的菌落的数量是在核转染后的3-4周才开始算的。其未分化的ipscs依靠人类胚胎干细胞培养基中的灭活的MEFs来维持。培养基成分：DMEM/F12上加入20%血清替代品，0.1mM非必需氨基酸，1mM谷胱甘肽，0.1mMβ-ME,10μg/ml重组人类碱性成纤维细胞生长因子和抗生素。为了预防细胞被MEFs污染，这些ipscs会被转移到无饲养层/无血清的HESFV2培养基中。如先前描述的那样，培养基中没有KSR的增补。2.4定量逆转录聚合酶链式反应SYBR-green被用于荧光实时逆转录pcr的检测。简略的说，每个样的总RNA（1μg）用0.5μg的Oligo-dT和200UsuperscriptⅡ反转录来进行逆转录至20μl。扩增是在一个总体积为20μl，包含着0.5μM的引物，4mMMgcl₂,2μlLightCycler-FastStartDNAMasterSYBRgreenⅠ，和2μl的1：10稀释的CDNA中实施的，并且所有反应都进行三份。基因的转录水平以相应的内参做标准，对由于每个候选基因，MRNA水平相对于最高的候选基因基因水平来说是以百分比来衡量的。2.5荧光免疫检验法将活细胞和sphere，放入4%的多聚甲醛溶液，用0.1%TritonX-100通透化处理后，并用5%正常山羊血清—PBS封闭。细胞与一抗一起培养，用PBS清洗三次，后与羊抗鼠二抗培养，并结合上FITC（绿）或PE（红）。DAPI是被用作为核燃料（蓝）。从荧光显微镜和数码相机获得图片。抗体排列（表一）。2.6诱导分化T-ipscs为神经元样细胞将1×105ipscs在无血清诱导神经元选择培养基上培养2周，传代5-8次。其筛选神经前体细胞的无血清培养基中包含了以下物质：DEME/F1：1，并加入了0.6%的葡萄糖，25μg/ml胰岛素，100μg/ml转铁蛋白，20nM孕酮，60μM腐胺，30nM氯化硒，2mM谷氨酸盐，3mM碳酸氢钠，5mMHEPES，2μg/ml肝素，20ng/ml表皮生长因子和20ng/ml碱性成纤维生长因子。为了进一步的分化，将表皮生长因子从培养基中移除并在培养基中加入20μg/mlSHH,10μg/mlBDNF,和全反式维甲酸，培养7天。2.7统计分析其结果表示为均值±标准偏差，用统计分析的T检验来比较两个组别。变异的一种或两种分析，Bonferroni法用来检测不同三组或更多组，其结果为P＜0.05时被认为是差异显著的。3.结果3.1外周血T细胞的分离和鉴定如附图1A所示，外周血是从六个23—38岁的捐赠者中获得。PBMNCs主要是由T淋巴细胞构成的，而且不仅有T淋巴细胞也有单核细胞和巨噬细胞。为了T细胞的扩增，我们进一步培养了被培养板包被anti-CD3单克隆抗体和IL-2分离出来的PBMNCs。anti-CD3抗体调节TCR-CD3诱导T细胞的增殖分化，而IL-2也活化普遍的T细胞信号通路和最终的促进转录的因子，细胞存活，细胞周期的进入。我们的数据显示，在PBMCs中培养的细胞数量明显增加（附图1B）。为了鉴定这些细胞，CD3蛋白的表达作为了T细胞—特异性参照物，并发现在和anti-CD3单克隆抗体和IL-2一起培养的第三天PBMCS培养的CP3-阳性细胞增长至90%（图1C和1D）3.2T细胞形成的iPSCS的鉴定在临床应用上，新发展出来的形成无外源基因整合的iPSCs的方法取代了整合病毒基因毒性。在本实验中，我们运用了EBNA1附着型载体，一个在饲养层依赖或不依赖的情况下都能够将体细胞重编程成iPSCs的非病毒系统。经电穿孔，从T细胞生成iPSCs（Fig.2A）。在质粒转染的28天胚胎干细胞样菌落开始显露出来并被筛选出来进行扩增。已建立的克隆形成扁平并密集的菌落并显出高的核质比和碱性磷酸的染色阳性，并且与人类ESCS形态难辨（Fig.2B和2C）。如免疫荧光显示，选择的克隆展示出多能性特性，并在T细胞来源的iPSCs中显示出oct4,NaNog,Tra-I-60,和Tra-I-81的较高的表达（Fig.2D）。RT-PCR也显出Ctrl-和AMD-IPSCs表达多种多能性基因，如oct4,Sox2-Klf4,NaNog,REX,DPDA2和GPF3这些与在H9人类ESC上观察到的相同（Fig.2E）。总体来说，这些结果证明了充分的重编程多潜能的iPSCs是可以有效地从T细胞中获得的。3.3人类T细胞来源的iPSCs分化成神经细胞我们跟着前面为了分化iPSCs成神经细胞所建立的方法。我们将iPSCs和ESCs从分化之前的饲养层成纤维细胞分离出来。Fig3A显示了神经球和神经球的外围的神经突起生长的典型特征，免疫标记表明分化的细胞主要是由成熟神经元构成。神经元诱导三周后，可知T-iPSC-Neus由大量网格和巢蛋白阳性构成，其和成熟神经元标志物MAP2一样（Fig3B)。qrTRT-PcR检测显示的神经元特异性标志物的表达，其包含的Nestin,GFAD,MAP2,NCNM1是在神经元分化后10天和20天的T-ips-Neus中初始表达的(Figs3cand3d)。按统计学分析的话，神经元-特异性标志物的MRNA的表达在其分化过程中的表达是增加的。多维定标（Fig3E），进一步的说明了T-ipsc-Neus的基因表达模式是与ESC-神经原的特征基因组相近的。总之，这些数据都说明T-ipscs可以多能性的分化成神经样细胞。4.讨论近来，人类体细胞的病者特异性神经细胞在神经变性的研究和个性化医疗的方面起到了变革的作用。为了重编程，ipscs的形成一定要从病人的体细胞来实施的。列如，皮肤成纤维细胞、头发角质细胞、上皮细胞和骨髓。多数ipscs的研究都把成纤维细胞当做体细胞来源，最具有侵略性也是最合适的方法。在先前的研究中，我们证实了在没有C-Myc的情况下从乳牙和恒牙中取出来的牙髓细胞也可以重编程成ipscs。这些ipscs也可以分化成神经样细胞。虽然从牙齿获得的牙髓细胞提供了另一种能够重编程的方法，但是从牙齿分离收集牙髓细胞也成了一个限制性因素。相反的，由于易于获得的病人样品，PBMNS被广泛的接受为一个更为方便及无限制来源的细胞。几项研究证明了从PBMNCs而来的ipscs，并且成功的分化PBMNs来源的ipscs成了间充质干细胞，心肌细胞和干细胞。这证明了从血液MNCs形成ipscs比其他细胞来源有更多的优势。（Table.1）这个比起皮肤成纤维细胞和牙髓细胞来获得外周血液是更加方便且具有少的侵害性。这个新的方法更是节省出了几周的