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1实验目录实验一：0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液的制备实验二：1%鸡红血球悬液的制备实验三：禽流感血凝试验实验四：禽流感血凝抑制试验实验五：口蹄疫病毒3ABC-ELISA抗体检测技术实验六：猪瘟病毒ELISA抗体检测技术2实验一0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液的制备一、目的要求掌握磷酸盐缓冲液的制备方法，为后续的血清学检测奠定基础。二、药械及耗材电子天平，小电炉，药匙，1000ml烧杯，玻棒，500ml三角瓶（带棉塞），pH试纸；Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaCl、蒸馏水；1NNaOH、1NHCl（滴管瓶塞）。三、试验程序配方：Na2HPO4.12H2O2.9克KH2PO40.3克NaCl8.0克蒸馏水1000ml将上述成分称量在烧杯中，加热搅拌溶解，待完全溶解以后，调整pH值至7.4。然后分装在3个三角瓶中（每瓶大约330ml），加棉塞，橡皮筋捆扎，置高压灭菌器中121℃15min灭菌处理，备用。3实验二1％鸡红血球悬液的制备一、目的要求掌握鸡红血球悬液的制备方法，为后续的血凝和血凝抑制试验奠定基础。二、药械与耗材公鸡，玻璃注射器（30ml），16＃大针头，5％柠檬酸钠；800型离心机，玻璃离心管（10ml），洗耳球，10ml移液管，2ml移液管，棉花；0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液。三、试验程序※从心脏采集公鸡的抗凝血约25ml，平均分装3支离心管；※作对称平衡以后，3000rpm离心10min，弃上清液，保留红血球泥；※加入适量PBS，用乳头滴管轻轻地洗涤红血球，然后作对称平衡，3000rpm离心10min，弃上清液，保留红血球泥；※重复上述操作2～3次，直至上清液清亮透明；※用10ml移液管轻轻地吸去上清液弃之，保留红血球泥；※用10ml移液管向三角瓶中加入49.5mlPBS，再用2ml移液管吸取0.5ml红血球泥，棉花擦去移液管外壁粘附的红血球。将0.5ml红血球泥放入49.5mlPBS中，混匀置于4℃冰箱备用。4实验三禽流感血凝（HA）试验一、目的要求流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体结构，HA试验由此得名。本试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。二、药械与耗材磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸盐溶液、96孔V型血凝板、50μL移液枪、25μL移液枪、微量振荡器。1%鸡红细胞悬液制备，参照实验二。三、诊断试剂和待检样本禽流感病毒血凝素分型抗原。四、试验程序※在微量反应板的1~12孔均加入25μLPBS，换滴头。※吸取25μL病毒悬液加入第1孔，混匀。※从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃去，换滴头。※每孔再加入25μLPBS。※每孔均加入25μL1%鸡细胞悬液（注：勿必将红细胞悬液摇匀）。※振荡混匀，在室温（20~25℃）下静置40分钟后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔红细胞将成为明显的钮扣状沉到孔底。结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）5的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。以使红细胞100%凝集的抗原最高稀释倍数作为血凝效价。6实验四禽流感血凝抑制（HI）试验一、目的要求流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。本试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。二、药械与耗材磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸盐溶液、96孔V型血凝板、50ul移液枪、25ul移液枪、微量振荡器。1%鸡红细胞悬液制备，参照实验二。三、诊断试剂和待检样本禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。四、试验程序根据HA试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4，即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1：256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256/4）。※在微量反应板的1～11孔加入25ulPBS，第12孔加入50μLPBS。※吸取25ul血清加入第1孔内，充分混匀后吸25μL于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。※1～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25μL，室温静置至少30分钟。※每孔加入25μL1%鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40分钟，对照红细胞将呈钮扣状沉于孔底。结果判定：以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于22，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于判定HI试验阴性；HI价等于23为可疑需重复试验;HI7价大于或等于24为阳性。8实验五口蹄疫非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验(NSP3ABC-I-ELISA)一、目的要求口蹄疫(FMD)是一种高度接触性传染病,传播迅速,可形成世界性大流行,对养殖业和国际畜产品贸易具有严重的负面影响。控制和消灭FMD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群在采用疫苗的国家,大多数动物血清口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白和病毒相关抗原(VIAA,即3D)抗体均为阳性。因此,一些基于结构蛋白和VIAA的诊断方法很难确定口蹄疫病毒感染与否。只有将感染动物和隐性带毒动物与疫苗免疫动物加以区分，才能为FMD的控制和消灭提供科学的依据。目前的疫苗生产工艺，在病毒纯化过程中去除绝大部分非结构蛋白，因此灭活疫苗免疫动物体内没有病毒非结构蛋白3BC抗体产生，而自然感染动物体内既有结构蛋白抗体，也有非结构蛋白3ABC抗体。因此检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物，而且可以区分感染动物和免疫动物。本试验采用FMDNSP3ABC-I-ELISA试剂盒检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体。用于活畜进口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，区分感染和免疫动物。二、药械及耗材2ml指弹头离心管，吸水纸，1～10ul移液枪，10～100ul移液枪,500ul移液枪，250ml烧杯，液体稀释槽，小、中、大移液枪尖。三、诊断试剂和待检样本3ABC-I-ELISA诊断试剂盒、待检血清样本。四、试验程序※将试剂盒配备的25倍浓缩PBST用无离子水或蒸馏水做1：25倍稀释待9用。※待检血清样品和阳性、阴性对照血清用血清稀释液1：21倍稀释（120ul血清稀释液加血清6ul），每孔加入100ul，阴、阳性对照血清样品平行加两孔，用封口膜封口，37℃结合30分钟。※取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。※用血清稀释液按1：100比例稀释酶标二抗，每孔加入100ul，用封口膜封口，37℃结合30分钟。※取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。※每孔加入50ul底物溶液B（H2O2）和50ul底物溶液A（TMB）混匀。封口膜封口，37℃避光作用10-15分钟。※每孔加入100ul终止液（H2SO4）。※轻轻摇振混匀，测定波长450nm吸光值。结果判定：阳性对照平均OD值应大于0.6；阴性对照应小于0.2。结果计算：样品效价为：（OD样品-OD阴性）/（OD阳性-OD阴性）。若效价0.2，为阴性；效价在0.2～0.3之间为可疑；效价0.3为阳性。可疑样品进行复测，仍为可疑判为阳性。五、试验安排与结果设一套阴、阳性对照。判定样品效价。图96孔酶标板布局图阴性阴性阳性阳性123456789101112ABCDEFGH10