血清蛋白电泳-醋纤电泳圆盘电泳

实验二血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯化和制备。在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。一、电泳技术电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即VQu==X6πrηV—粒子运动的速度X—电场强度Q—粒子所带电荷r—粒子的半径η—介质的粘度影响电泳速度的因素1、影响电泳迁移率的外界因素：☺电场强度☺溶液的pH值☺溶液的离子强度☺电渗现象2.影响电泳迁移率的内在因素：☺样品所带净电荷的量☺样品的大小和形状掌握电泳法分离血清蛋白质的原理掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义二、实验目的本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。三、实验原理经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。γβα2α1清蛋白蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7.50156000~300000人血清蛋白质的等电点及分子量1.实验材料：未溶血的人血清2.实验试剂：巴比妥缓冲液氨基黑10B0.5％染色液漂洗液透明液3.实验器材：醋酸纤维薄膜（2×8cm）常压电泳仪镊子点样器玻棒粗滤纸培养皿吸量管直尺及铅笔四、试剂及器材1.准备醋酸纤维素薄膜的预处理：将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光滑面和粗糙面。标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端1.5cm处划线即为点样线并作好标记。五、试验方法电泳槽的准备电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。根据电泳槽膜支架的宽度，裁减尺寸合适的率纸条，放入电泳槽，待滤纸条湿润后，用玻璃棒挤压排气，使滤纸紧贴膜支架。2.点样（关键）取出浸透的薄膜，平放在滤纸上(无光泽面向上)，用滤纸轻轻吸去多余的缓冲液，薄膜的粗糙面向上平放在点样模板上，底边对齐，点样区距负极1.5cm。点样时，用磨光的玻片蘸取血清后，均匀的涂抹在点样区，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。（见图）注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。另外操作过程要防止指纹污染。3.电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，使膜平衡10min。连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度。通电10min-15min后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度，电泳时间50min。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。点样端1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板4.染色电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。5.漂洗用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每10min左右换一次液，连续更换数次，直至背景颜色脱去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。6.记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在实验本上，并判断分析其结果。清蛋白121、洗脱法：剪下各蛋白区带0.02mol/LNaOH洗脱将洗脱液用分光光度计比色结果计算每种蛋白质占总蛋白质量的相对含量=该种蛋白管光密度读数各管光密度读数之和×100%六、各蛋白组分的定量2、光密度计扫描法清蛋白12清蛋白12血浆蛋白是血浆最主要的固体成分，含量60～80g/L绝大部分由肝脏合成，仅γ球蛋白由浆细胞合成正常值：白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％γ球蛋白12％—20％血浆蛋白的主要功能:维持血浆胶体渗透压调节血浆pH值,维持酸碱平衡运输营养物质,代谢物,激素,药物及金属离子等免疫作用七、临床意义急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2和β球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白升高；急性炎症：α1、α2球蛋白升高；慢性炎症：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，γ球蛋白显著升高；多发性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β和γ球蛋白区带之间出现“M”带。注意事项1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。2、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。4、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。5、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。实验三血清蛋白质聚丙酰胺凝胶圆盘电泳1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2.掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的操作技术一、实验目的二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。根据有无浓缩效应可分为：连续系统与不连续系统，其中不连续系统因具有浓缩效应，分离条带清晰度及分辨率较佳应用更为广泛，本次试验应用的为不连续系统。以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)。为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率,通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离胶上面有一层浓缩胶，因浓缩胶和分离胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳开始后，由于浓缩效应,较厚的蛋白质加样层可以被浓缩成很薄的蛋白质层，使电泳具有良好的分辨率。浓缩效应：浓缩胶的浓度小于分离胶的浓度，因凝胶孔径的不连续使样品迁移受阻而压缩成很窄的区域，从而提高分离效果。缓冲液离子成分、PH的不连续性也能造成浓缩效应：电极缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶（浓缩胶）中缓冲液为pH6.7Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电荷越多迁移越快三大效应成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.7浓缩胶Cl-(快离子)6.7大分离胶Cl-(快离子)8.9小有效迁移率=迁移率解离度氯离子蛋白质阴离子甘氨酸阴离子不连续系统三、实验器材与试剂1.实验材料：正常人血清2.实验器材：圆盘电泳槽、电泳仪、玻璃管（10cm×0.6cm）、洗耳球、培养皿、微量加样器、注射器、小烧杯、脱色摇床试剂号配方PH1单体交联剂丙烯酰胺（Acr）30g甲叉丙烯酰胺（Bis）0.8g加蒸馏水到100ml2过硫酸铵1g+10ml蒸馏水3四甲基乙二胺（TEMED）4电泳缓冲液硼砂30.512g硼酸4.948g蒸馏水定容至1000ml工作液：90ml贮储液+1440ml水9.05固定液三氯乙酸12.5g蒸馏水定容至1000ml6染色液CBBG-2500.1g溶于95%乙醇后，加蒸馏水到100ml3.实验试剂7分离胶缓冲液Tris6.06gEDTA1.17g定容至100ml8.88上样缓冲液电泳缓冲液25ml蔗糖10g0.05％溴酚蓝5ml加蒸馏水至100ml9洗脱液、保存液冰乙酸38ml甲醇125ml蒸馏水338ml四、实验方法1.凝胶柱的准备（1）取一只10cm×0.6cm洁净﹑干燥的玻璃管，在7cm和8cm两处做一个记号，一端用封口膜严实，垂直放好。（2）.按下表配制分离胶溶液试剂分离胶（ml）分离胶缓冲液单体交联剂双蒸水10％过硫酸铵TEMED12.16.80.10.01把分离胶溶液混匀后，用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7cm高。（3）凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。（4）将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，先用习惯吸去上面的水层，在用滤纸将残留的水分吸干。2.样品液制备取正常人血清0.1ml，与1.9ml的上样缓冲液混合3.装柱将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜)。用微量注射器吸去混合后的样品液30μl加到分离胶面上（加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散），最后加入电泳缓冲液。4.电泳接通电源，上负下正，调节电流3mA/管，电压260V-280V，待示踪染料离管下口0.5cm时切断电源。5.剥胶注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离，最后用洗耳球在管的一端轻轻挤压，另一端对着一干净大小适宜的培养皿内，此时可以将凝胶柱压出玻管。6.固定和染色用固定液浸泡凝胶条，此过程用来固定蛋白质，10min后倒去固定液，再加入染色液，在90℃水浴染色15min，倒去染色液。7.脱色将染色完毕的胶条用脱色液浸泡，中间更换1~2次脱色液并浸泡过夜，将浮色脱去进行观察染好色的蛋白带丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，可经皮肤、呼吸道等吸收，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触，故操作时要注意保护没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近，实验中全部的胶统一放到指定的容器中，由专门的人收集到一起，统一处理。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值是否失效。失效液不能聚合。加速剂（TEMED）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，防止氧化失效。配好胶后应尽快灌胶（不要形成气泡）切记装柱后应用蒸馏水密封灌胶和电泳时要注意排气泡加样时不能损伤凝胶表面电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直固体胶切