血红蛋白的提取和分离

血红蛋白的提取与分离蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。【基础知识】㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、概念：根据被分离蛋白质的，利用具有网状结构的凝胶的分子筛选作用，来分离蛋白质的有效方法。2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3、具体过程：A.的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。B.（1）混合物上柱；（2）洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。（4）不同的蛋白质分子完全分开；（5）的蛋白质行程较短，已从中洗脱出来，的蛋白质还在行进中。㈡缓冲溶液：1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。2、作用：能够抵制的对溶液的的影响，维持PH基本不变。3、缓冲溶液的配制通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得使用的缓冲液㈢电泳：1、概念：指发生迁移的过程。凝胶颗粒相对分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板2、原理：许多重要的生物大分子，如等都具有在下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身、的不同使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。3、分类：电泳电泳。测定（蛋白质相对分子质量）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于。（第二课时）实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定1.样品处理(1)红细胞的洗涤①目的：去除②方法：离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层的红细胞液体倒入再加入质量分数为0.9％的氯化钠溶液，缓慢搅拌10min,离心低速短时间离心。重复洗涤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。思考：洗涤次数为什么不能过少？离心速度和时间为什么不能过高和过长？(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加到体积，再加40％体积的（溶解细胞膜），置于上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:第1层（最上层）：甲苯层第2层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体阴极阳极加入待分离的样品带电性质、分子大小和形状的不同，使分子迁移速度不同分子向阳极移动缓冲液琼脂胶溶液槽凝胶电泳原理示意图第3层（中下层）：的水溶液层，的液体第4层（最下层）：其它杂质的沉淀层(4)透析2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②柱底部的制作：a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在0.5mL的头部切下长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。c.剪尼龙网小圆片覆盖在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液管头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一端放入收集的收集器内③柱顶部的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择：。（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。（3）凝胶色谱柱的装填方法①固定：将色谱柱处置固定在支架上②装填：将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。②洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用300mL的20mmoL/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分12小时。思考：为了加速凝胶的膨胀，我们可以如何操作？凝胶的装填为什么要紧密、均匀？3）样品加入与洗脱（1）加样前：打开色谱柱下端出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口。（2）加透析样品①调整缓冲液面：与凝胶面平齐③加透析样品：用将1mL的样品加到色谱柱的④样品渗入凝胶床：⑤洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑥收集：待接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集一试管连续收集思考：在蛋白质分离过程中，色谱柱制作成功的表现是什么？思考：与其它蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度电泳方法步骤1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备3）样品处理：4）把凝胶固定于电泳装置上5)加样：按顺序加样，加样量通常为10—25μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品6)电泳7）剥胶8）染色9)脱色10)观察结果SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。实验结果分析与评价观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。【思考】如何测定蛋白质的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。一、选择题1、凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A、改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B、吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C、将酶或纽胞固定在凝胶中D、与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度2、下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是()A、层析柱高B、层析柱的直径C、缓冲溶液D、样品的分布3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是()A、蛋白质分子所带的电荷B、蛋白质分子的形状C、蛋白质分子的相对分子质量D、缓冲溶液的pH