血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)

血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）主要内容一、基本概念二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用三、基本操作四、注意事项一、基本概念1、血凝试验(HA)1.1定义某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA)。常见于正粘病毒（如AIV）、副粘病毒（如NDV）和某些黄病毒（如JEV）、痘病毒、以及经过处理过后的IBV。1.2血凝类型：(1)可逆转型血凝素与病毒颗粒易分开，经超速离心后，病毒颗粒沉淀于管底，血凝素则游离于上清液内。这种血凝素凝集红细胞的现象是可逆的，即被凝集的红细胞释放了吸附于表面的血凝素后，可再与该血凝素发生凝集。如天花、鼠疫等病毒。(2)不可逆转型血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密，不经过特殊处理血凝素不能与病毒颗粒分开，这种病毒引起的红细胞凝集，是不可逆转的。在一定的温度(37℃)下，病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键的N-乙酰神经氨酸酶，当病毒颗粒从红细胞表面游离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集病毒的能力。如流感病毒、鸡新城疫病毒等。(3)凝集条件严格型有些病毒及其血凝素凝集红细胞的条件很严格，不仅对不同种动物的红细胞有严格的选择，即是对同种动物，由于性别和年龄的不同，对红细胞的凝集性能亦有差异（如JEV对公鹅的红细胞凝集性能比对经产老龄母鹅的红细胞凝集性能好）。除此之处，还对缓冲液的pH值、温度及盐浓度等的要求均很严格。1.3原理血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。2、血凝抑制试验(HI)2.1定义当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutinationinhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HI)。该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。2.2原理特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用1、用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。2、HI试验可用于发病禽群的诊断鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和离散性有助于诊断。例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊断禽群是否患有新城疫或禽流感等。3、对禽群的免疫状态进行评价禽群或个体血清中的HI抗体水平与疫苗的免疫和对相应强毒侵袭的抵抗力都有密切关系。以新城疫为例，当HI抗体在7Log2以上进行活苗免疫时，由于高抗体可中和绝大部分的疫苗病毒，产生的免疫力很弱；HI抗体在5Log2～6Log2时，活苗免疫效果也受到一定的干扰；当HI抗体在4Log2以下时，活苗免疫效果良好，但对强毒感染抵抗力下降。一般认为，成年鸡新城疫的HI抗体水平在5Log2以上时，保护率在90％以上，4Log2以下时只有50％的鸡对强毒有抵抗力，2Log2以下时80％以上的鸡易感染新城疫。由于雏鸡母源抗体对疫苗首次免疫效果影响很大，了解母源抗体水平对疫苗免疫有重要意义。研究表明，母鸡血清抗体、卵黄抗体和5日龄雏鸡母源抗体三者之间有相关性，卵黄抗体与母鸡血清抗体基本一致，而1日龄雏鸡血清抗体低于卵黄抗体一个滴度，可检测种鸡卵黄抗体、估测1日龄雏鸡母源抗体水平。雏鸡新城疫母源抗体半衰期约为5天，免疫临界点为3Log2，这样可依据抗体水平，确定最佳免疫时间。三、实验步骤（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）1阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。21%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。2.2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。2.310%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800r/min8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红细胞混合均匀。2.41%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1mL，加入9mLPBS，混合均匀即可。3抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1在微量反应板的1孔～12孔均加入25μLPBS，换滴头。3.2吸取25μL病毒悬液加入第l孔，混匀。3.3从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃之，换滴头。3.4每孔再加入25μLPBS。3.5每孔均加入25μL体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。3.7结果判定将板倾斜，观察血凝板，判读结果将板倾斜（45度左右），观察血凝板，判读结果：++++：红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集＋＋＋：红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈＋＋：红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块＋：红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块－：红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意！对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效4、血凝抑制试验（HI试验微量法）4.1根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。4.2在微量反应板的1孔～11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS。4.3吸取25μL血清加入第1孔内，充分混匀后吸25μL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。4.41孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25μL，室温（约20℃）静置至少30min。4.5每孔加入25μL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4.6结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。四、注意事项目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果。1、注意抗原相的差异实践中，经常会出现不同厂家生产的相同亚型的禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同，这是由于禽流感病毒变异较快，存在抗原相的差异。禽流感病毒株按其血凝抑制试验中所表现的亲和力不同而分为三种类型：对本株和异株免疫血清均呈较高效价的为“R”相；对本株效价高对异株低的为“P”相；对本株及异株均低的为“Q”相。如果在试验中出现相的差异，所测结果会相差2-3个滴度，所以在血凝抑制试验操作时，挑选亲和相毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的灵敏度。2、注意消除非特异性因素禽类血清中，尤其是水禽血清，往往含有非特异性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制试验时会出现2-3孔有凝集现象。因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测定之前，有必要对血清中非特异性因子进行排除。常用消除方法（FAO推荐）1、鸡的红细胞吸附法1.1试剂鸡的红细胞：要充分洗涤；PBS：pH7.5，4℃保存；阳性对照血清；阴性对照血清。1.2方法加入25µL鸡的红细胞到100µL血清中；4℃，用微量振荡器振荡20-30min；加入100µL灭菌PBS(用RDE处理的血清除外)；4000转离心1min；取出上清，进行HI试验；用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应。2、RDE（受体裂解酶）消除法2.1试剂：RDE：用20mL无菌PBS稀释，小量分装，-20℃保存一周，注意避免反复冻融；PBS：pH7.5，4℃保存；阳性对照血清；阴性对照血清。2.2方法：2.2.1鸡血清加3倍体积的RDE到1倍体积的血清中；充分混合；56℃水浴30-60min;加入6倍体积于血清体积的PBS。2.2.2其它禽类血清依据用RDE处理鸡血清方法处理后，继续按下列方法进行：用25-5µL鸡的红细胞到500µL血清中；4℃，用微量振荡器振荡20-30min；4000转离心1min。3、热灭活法3.1鸡血清取100µL血清样品放入一灭菌离心管中；各取100µL阳性血清和阴性血清加入到另2个灭菌离心管中；56℃水浴30min。3.2其它禽类血清血清用鸡的红细胞处理后，分别取100µL样品、阳性血清、阴性血清放入灭菌离心管中，56℃水浴30min。热灭活是一种排除非特异性因子的有效方法，但对特异性抗体破坏较大。采用1%同源禽种红细胞作为指示细胞进行水禽血清抗体效价测定，将结果降低1个滴度作为测定结果（朱燕秋等《中国兽医杂志》2009，45（2）42-43）。3、注意抗原的标定在禽流感血凝抑制试验中抗原标定至关重要的一个环节。抗原配制完后，需对所配制的抗原进行标定，看所配制的抗原是否达到所需标准，如工作抗原效价过高或过低对结果都有一定的影响。过高，测定抗体效价偏低；过低，测定效价过高，甚至