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原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列不编码蛋白质；调控遗传信息的表达,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的边转录边翻译编码区是间隔的、_____的，先转后翻相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码原核细胞与真核细胞的基因结构比较目的基因的获取1基因表达载体的构建23将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成未知序列已知序列（一）从基因文库中获取目的基因1.基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2.基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.基因文库的目的：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因基因文库的构建某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA问题1对于真核生物为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有这种生物的部分基因？这个部分基因与原基因相同吗？某个时期的发育是基因选择性表达的结果，而且与原基因不同，不含非编码区和内含子。怎样从基因文库中获取我们所需的目的基因呢?根据目的基因的相关信息：如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。问题2（二）利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：DNA复制模板DNA；引物一对；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶2原理：原料：已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一PCR技术扩增过程变性退火延伸PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成（三）人工合成法在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成思考：人工合成法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？问题33、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________获取目的基因的三种方法应用1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用____________2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用________________PCR技术扩增化学方法人工合成构建基因文库的方法4、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、cDNA文库法D、聚合酶链反应5、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③AD二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的：2基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端注意：①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构；②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键；③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少；④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。三、将目的基因导入受体细胞1转化：2常用的受体细胞：3目的基因导入受体细胞的原理：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径（一）目的基因导入植物细胞1.农杆菌转化法①农杆菌特点：②原理：易感染双子叶植物和裸子植物（酚类化合物），对大多数单子叶植物没有感染能力。Ti质粒上的T—DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达③过程：（一）目的基因导入植物细胞2.基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞①操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。②钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。③适用：单子叶植物（一）目的基因导入植物细胞3.花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞②特点:十分简便经济。③例：转基因抗虫棉（二）将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法过程：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物（三）将目的基因导入微生物细胞1.微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少2.常用菌：大肠杆菌3.常用法：Ca2+处理获得感受态细胞4.过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合小结：将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测（一）鉴定——分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术变性变性（一）鉴定——分子水平的鉴定变性方法——分子杂交技术2.检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N（一）鉴定——分子水平的鉴定提取3.检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养（二）鉴定——个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D课堂练习3、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D【拓展深化】工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。课堂练习4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达C【拓展深化】只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对课堂练习即时应用(随学随练，轻松夺冠)5．(2009年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达D