读书报告(二)

西北农林科技大学2013级硕士研究生读书报告学院：动物医学院学科、专业：预防兽医研究方向：分子病原学与免疫学研究生：周铭指导教师：陈德坤教授IL-22能够在甲型流感病毒感染过程中减轻肺部炎症并且保护肺免受继发性细菌感染摘要：IL-22在自身免疫性疾病、炎症反应和传染性疾病中具有保护或致病的作用。这里，我们要研究在致命和非致命的呼吸性H3N2甲型流感病毒(IAV)感染过程中，IL-22在宿主防御和发病机理方面的潜在作用。结果表明，IL-22以及与其产生相关的因子在IAV感染的早期阶段于肺组织中均有表达。数据显示，RORγt阳性αβ和γδＴ细胞和固有淋巴细胞，表现出在感染后２天IL-22的合成加强。在致死和非致死的IAV感染中，内源性IL-22在抑制IAV复制和在IAV-特异性CD8+Tcell应答过程中没有发挥作用。在致命性感染中，野生型小鼠死于重症肺炎，缺乏IL-22并没有使IAV发病和动物死亡加速或延迟。对照组中，在非致命性IAV感染过程中，缺少IL-22的动物肺部损伤加强并且相对于野生型同窝出生的幼鼠显示出较低的气道上皮细胞完整性。重要的是，内源性IL-22在肺损伤中的保护作用与进一步控制继发性细菌感染有关。在攻入肺炎链球菌后，就存活率和肺部细菌负荷而言，感染过IAV的IL22/动物较野生型动物对照更易受到影响。IL-22在致命性感染中虽然不发挥重要作用，但在非致命性IAV感染中是有益的，它可以减轻肺部炎症反应和随后的继发性细菌感染。IL-22在自身免疫和炎症性疾病中发挥双重作用。它是由传统的淋巴细胞和淋巴细胞产生的。IL-22只作用于非造血细胞，包括肝细胞和上皮细胞，依靠在组织表达IL-22发挥促炎和组织保护的作用。在非传染性的实验系统中，IL-22对肝细胞和上皮细胞屏障表面产生一种强有力的保护作用，尤其是在在小肠和胸腺。IL-22也是控制粘膜免疫力和来自肠道共生的细菌的传播的重要因子。在肺中，IL-22保护实验性的肺纤维化和诱导型的肺损伤。IL-22还限制由Th2介导的哮喘中气道炎症和组织损伤。另一方面，不受控制的IL-22生成加重皮肤炎症和棘皮症，以及博来霉素诱导的气道炎症，胶原蛋白诱导的关节炎，脂多糖冲击，在一定程度上提高组织的炎症，与肿瘤坏死因子α和IL-17等炎性因子类似。在感染过程中，由先天的细胞或传统的效应T细胞依靠病原体和组织扮演双重角色。早期通过先天免疫细胞产生的IL-22是对细胞外细菌宿主保护性免疫的关键。包括肺中的肺炎杆菌和肠道中的柠檬酸杆菌。另一方面，IL-22在宿主防御金黄色葡萄球菌,结核分枝杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌,白色念珠菌,曼氏裂体吸虫中没有实质性作用。重要的是，IL-22能够在自适应免疫系统受损时为天然免疫提供保护。这个功能已经在白念珠菌和艾美球虫感染过程中被描述过。最后，IL-22对肠炎的有害性作用在口腔感染刚地弓形虫后被报道。材料和方法病毒，细菌和老鼠。高致病性人H3N2甲型流感病毒。IL22/小鼠，在C57BL/6中至少杂交10次，同窝出生的野生型对照也是如此。RORγt绿色荧光蛋白小鼠。8-10周龄大雄性小鼠。抗体和试剂。抗小鼠TCRβ，TCRγδ单克隆抗体，CD45，NKp46，CD127，CD90.2，链霉亲和素，CD4。抗小鼠IL-22单克隆抗体，重组的IL-22。IAV感染和定量RT-PCR对基因表达的评估。对小鼠进行麻醉，鼻内接种50μLPBS，包含不同剂量(50或600PFU)的H3N2病毒。从完整肺中或从受IAV感染的小鼠支气管肺泡灌洗液中重获的细胞中提取总RNA，cDNA通过经典程序合成。具体的引物gapdh,，Ifng，IL17α，mx1，Ifnb，IL22和IAVM2基因之前已描述过。此外，用到了下列引物：IL22bp，5´-ACTCTGCCTGGACCAGGACA-3´和5´-GAGAAGCACCCGCAAAGATG；IL23p19,5-AATCTCTGCATGCTAGCCTGG-3´和5´-GATTCATATGTCCCGCTGGTG-3´;IL1b,5-TCCCCAACTGGTACATCAGCA-3´和5´-ACACGGATTCCATGGTGAAGTC-3´;Rorgt,5´-TGAAAGCAGGAGCAATGGAAGT-3´和5´-ACAGCTCCACACCACCGTATTT-3´;Ahr,5´-ATCGACATAACGGACGAAATCC-3和5´-TTAGGTGCTGAGTCACAGGCTG-3´;IL6,5´-AGCCTCCGACTTGTGAAGTG-3´和5´CTGATGCTGGTGACAACCAC-3;IL17f,5´-TGTCCTCCCCTGGAGGATAAC-3´和5´-GAACTGGAGCGGTTCTGGAA-3;IL21,5-AAACTCAAGCCATCAAACCCTG-3´和5´-TGTTTCTTTCCTCCCCTCCTG-3´;Tnfa,5´-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3和5´-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3´。△CT值通过扣除原始周期阈值获得，测CT是为了获得gapdhmRNA，它是研究基因内参标准。IAV感染过程中IL-22在RORγt阳性细胞中的转录水平分析RORγt-GFP小鼠被IAV感染或不感染，肺部单核细胞是被感染了60h后的，RORγt阳性αβＴ淋巴细胞(CD45+TCRβ+），γδＴ淋巴细胞(CD45+TCRγδ+)和TCRαβ-TCRγδ-（CD45+TCRβ-TCRγδ-)细胞从感染了IAV小鼠体内分离得到。IL-22转录表达通过定量RT-PCR完成。对IL-22生成细胞的分析。在IAV感染后两天进行对IL-22生成细胞的相关评估。作为一个可能的对照，肺部单核细胞在完全培养基中培养（含10ng重组的小鼠IL-1β/ml和IL-23加上10μg布雷菲德菌素A/ml，于37℃培养4h。激活后，对细胞进行清洗并用染色固定30min。清洗后细胞用适当稀释的eFluor605NC-conjugatedCD45,PE-conjugatedPBS-57-loadedCD1dtetramer,V450-conjugatedantiTCRβAb进行温育，于含2%胎牛血清PBS中进行PerCP-Cy5.5-conjugatedanti-TCRγδAb孵育30min。清洗后用IC固定剂固定。固定后的细胞进行透化，之后用APC-conjugatedMAbagainstIL-22orcontrolmouseIgG2aMAbandanalyzedonaLSRFortessa进行着色。为了分析固有淋巴细胞在RORγt+TCRαβ-TCRγδ-细胞中的比例，来自RORγt-GFP小鼠的肺单核细胞被适当稀释的APC-H7-conjugatedanti-CD45,Percp-Cy5.5-conjugatedanti-TCRγδ,V450-conjugatedanti-TCRβ,abiotinlineage-specificAbcocktail(TER119,CD11b,Gr1,B220,CD3,CD11c,andNK1.1)plusaPE-conjugatedstreptavidin,PE-Cy7-conjugatedanti-CD127,andAlexaFluor700-conjugatedCD90.2所标记。细胞在多维高清流式细胞分析仪上进行分析。病理学和死亡率评估。在IAV(600or50PFU)感染后，每天对小鼠发病状态和死亡率进行监测，持续17天。疾病通过测量肺部炎症,肺部病毒量，致死率来评估。对于垂死的小鼠进行安乐死并认为死于当天。为进行病理组织检查，将肺在含3.2%多聚甲醛的PBS中浸泡，然后用石蜡进行包埋。为了评估气道炎症，我们将肺切片(5-μm）用苏木精和伊红进行染色固定。对病毒量和IAV阳性CD8+T细胞应答的分析。肺为匀浆态，病毒滴度在Mardin-Darby犬肾细胞上用标准空斑形成实验测定。Ifnb和mx1mRNA表达水平用定量RT-PCR测定。IAV阳性CD8+T细胞数量根据已知报道测定。这样，特定的具有优势免疫表位Db-restrictedCD8+T细胞能够从病毒聚合酶2蛋白(PA224-233)中获得。简单地说，肺单核细胞用适当稀释的APC-conjugatedanti-CD19，荧光素标记的anti-CD8和PE-conjugatedPro5主要组织相容性复合体五聚体H-2DbSSLENFRAYV进行孵育。为了评估病毒特异性CD8+T细胞，从肺纵膈淋巴结中分离的肺细胞用SSLENFRAYV(10g/ml)进行刺激，细胞因子的产生用ELISA进行测定。肺炎链球菌继发感染。早期被IAV(50PFU)感染或未感染的小鼠，接种104I型肺炎链球菌。在幼年动物中，这个剂量是自限性的,因为老鼠能够在24小时内清除细菌。在一些情况下，IL22/小鼠在感染IAV和肺炎链球菌前注射重组IL-22(5g/mouse)或PBS。每天对小鼠发病状态和死亡率进行监测，持续13天。肺部活菌数在感染肺炎链球菌24h后进行测定。菌落形成单位（CFU）在24h后计算。统计分析。结果用标准偏差和标准误表示。不同实验组之间差异的显著性由单向方差分析算出。结果中显著性＜0.05认为差异显著。(*,P＜0.05；**,P＜0.01；***,P＜0.001)。结果在IAV感染早期阶段，在肺部有IL-22产生。虽然我们和其他研究者已经表明NK细胞和iNKT细胞是H1N1或H3N2IAV感染后2天IL-22产生的主要来源，但IL-22在IAV感染早期的表达动力学是不清楚的。如图1A中左侧部分所示，相对于空白对照组，被IAV感染小鼠的肺组织和肺泡中IL-22基因转录水平在第2天和第4天增加了约10倍。IL-22蛋白质浓度在第2天也有增加，但在第4天没有增加，如图1A中右侧部分所示，出现这个现象可能是由于蛋白质的快速消耗。IL-22的活性在体内能够被特异性的IL-22生成结合蛋白所中和。如图1B所示，肺组织中IL22bp信使水平在第2天和第4天时有轻微的下调（2倍），在支气管肺泡灌洗液（BALs）中下降的更多（20倍）。IL-22与IL22bp的比率在BALs中比肺组织中高出10倍，并且在感染后第2天和第4天没有显著差异。IL17a和IL17f的转录水平在感染后第2天和第4天的BAL细胞中也有上调，但在肺细胞中没有上调，而IL21，IL-17家族的另一个成员,也没有变化。IL-17A蛋白浓度只在支气管肺泡灌洗液中检测到在感染后第2天增加。IL-23，IL-1β，IL-6和TNF-α已被描述成在某些情况下参与早期IL-22的产生。如图1C所示，BAL细胞和肺中的IL-23，IL-1β，IL-6和TNF-α基因转录在感染后第2天和第4天强烈上调。在这些时间点上IL-23，IL-1β，IL-6和TNF-α蛋白水平也有明显增加（图1D）。RORγt，小部分的AHR，作为IL-22合成过程中至关重要的转录因子，在转录水平上也有上调（图1E）。总的来说，IL-22以及调节其表达的相关因子，在H3N2IAV感染早期阶段于肺中均有产生。在IAV感染早期，表达RORγt的细胞的IL-22转录水平增加。我们利用RORγt-GFP小鼠来分析IAV感染期间IL-22早期的来源。如图2A所示，从IAV感染的小鼠体内提纯的RORγt阳性细胞表达出IL-22基因转录水平增强，与未感染的小鼠体内分离的RORγt阳性细胞形成对比。流感病毒感染并没有引起RORγt阴性细胞中IL-22信使表达。NKp46+细胞在肺组织中并没有表达RORγt，也没有产生IL-22mRNA对IAV做出应答（图2B）。为分析IL-22基因转录表达，不同的肺部表达RORγt的细胞亚群被从空白对照和IAV感染动物中分离出来。与早期的研究一致，αβＴ淋巴细胞和γδＴ淋巴细胞代表了两种表达RORγt的主要亚群（图2C，上图）。来自αβＴ淋巴细胞池的iN