补体结合试验人外周血单个核细胞的分离实验

补体结合试验&人外周血单个核细胞的分离实验【补体结合试验】一、实验原理：补体无特异性，可以与任何抗原抗体复合物结合而被激活，但是不能与单独的抗原或抗体结合。补体结合实验（CET）是一种有补体参与，以绵羊红细胞和溶血素（抗绵羊红细胞的抗体）作为知识系统的抗原抗体反应体系。绵羊红细胞与溶血素结合后可激活补体。导致红细胞破坏，出现溶血现象。参与补体结合反应的五种成分可以分为两个系统。①待检系统：已知抗原（或抗体）、待检抗体（或抗原）。②指示系统：SRBC、溶血素。待检系统与补体作用后，加入指示系统，若不出现溶血，表示待检系统的抗原与抗体相对应，两者特异性结合形成抗原抗体复合物结合并消耗了补体，无游离的补体与指示系统结合，故不溶血，为补体结合实验阳性。反之，若出现溶血，则为补体结合实验阴性。二、实验方法：1.取五支试管，依次做好标记，放在试管架中。2.按照下表加样。试管号待检血清抗原补体NS摇匀37摄氏度水浴15min溶血素SRBC摇匀37摄氏度水浴15min结果1试验管0.20.20.2——0.20.2——2血清对照0.2_0.20.20.20.2溶血3抗原对照-0.20.20.20.20.2溶血4补体对照--0.20.40.20.2溶血5SRBR对照---0.8—0.2不溶血三、实验结果：四、结果分析：1.羊血用前轻轻摇匀，避免剧烈正当引起溶血。2.各种试剂的吸管不要混用。3.补体的性质较不稳定，低温保存，加样时再从冰箱里取出。4.水浴时避免水滴滴进试管。5.本实验影响因素很多，对照组的反应情况是否正常是判断实验可信度的参照。6.本次试验结果如图所示，其中1号试管和3号试管结果出现错误，分析实验流程可知，可能是在水浴过程中混入水滴所致或实验过程中对试剂没有摇匀。下次实验一定注意。【人外周血单个核细胞的分离实验】一、实验原理：分离PBMC的常用方法有物理方法（如密度梯度离心发、细胞比重法等）；化学方法（如低渗盐水法、氯化铵溶红细胞法）等。本次试验使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法。这种方法中常用来分离人外周血单个核细胞的分离液是由聚蔗糖和泛影葡胺按一定比例混合制成。它分子量大又无化学活性，20摄氏度时比重约为1.077kg/L，淋巴细胞和单核细胞比重略小于分层液，为1.070kg/L左右。而粒细胞和红细胞比重大，为1.092kg/L左右。通过离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，淋巴细胞和单核细胞位于分离液的上层，而粒细胞和红细胞沉于离心管的管底，从而将淋巴细胞和单核细胞等单个核细胞分离出来。二、实验方法：1.抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5mlHank’s液稀释。2.混匀后取3ml稀释液，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中。2000rpm,离心20min。3.小心吸取淋巴细胞层，加入2mlHank’s液，2000rpm,离心10min。4.弃上清，加入2mlHank’s液。2000rpm,离心10min。5.弃上清，加入2mlHank’s液，制片观察。三、实验结果：四、实验分析：1、抽取人外周静脉血的时候要注意无菌操作。还应注意生物安全保护，避免血源性传染病。2.操作全程应尽可能在较短时间内完成，以减少死细胞的数目。3.一定要用水平砖头的离心机，且离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，以保持细胞界面的清晰。4.注意血制品的污染。5、注意加入Hank’s液时不要打破界面。6.本次试验较为成功，能清晰的观察到人单核细胞。