表没食子儿茶素没食子酸酯调控自噬抗心肌缺血再灌注损伤的作用

表没食子儿茶素没食子酸酯调控自噬抗心肌缺血再灌注损伤李春凤，孙瑶，简洁*（桂林医学院，广西桂林541004）[摘要]目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）调控自噬抗心肌缺血再灌注损伤的作用。方法56只SD大鼠随机分为假手术、模型、自噬阻断剂（3-MA）、EGCG四组（n=8），采用左冠状动脉前降支结扎法制备大鼠心肌缺血再灌注模型，按试剂盒说明书检测缺血30min.及缺血/再灌注1h.各组肌酸激酶同工酶（CK-MB）、总抗氧化力（T-AOC）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的含量，以Western-blot法检测心肌微管相关蛋白轻链3蛋白-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin-1、雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）的表达。结果再灌注1h.时自噬的发生比缺血期显著；与模型组相比，EGCG能有效提高T-AOC，降低CK-MB及iNOS的含量，下调LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达，上调mTOR蛋白表达（P0.05）。结论自噬在缺血期即发生并随着缺血/再灌注时间延长而进一步加强；EGCG预处理可抑制心肌缺血及再灌注时段自噬的发生，进而增加心肌抗氧化力，减轻心肌缺血再灌注损伤。[关键字]表没食子儿茶素没食子酸酯；心肌缺血再灌注损伤；自噬EffectsofepigallocatechingallateonadjustingautophagyinmyocardialischemiareperfusioninjuryLIChun-feng,SUNYao,JIANJie*（GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi,541004）[ABSTRACT]Objective:TostudytheeffectsofEGCGonadjustingautophagyinmyocardial[基金项目]2011年广西高等学校优秀人才资助项目（桂教人[2011]40号）[第一作者]李春凤，女，硕士学位，副教授，从事药物临床研究，Tel:[phone]，E-mail：[e-mail].[通讯作者]*简洁，女，博士学位，教授，从事天然药物成分分离及心血管药理研究，Tel:[phone],E-mail:[e-mail]:56SDratswererandomlydividedintocontrol,model,3MAandEGCGgroup(n=8).30min.ofischemiaorischemia/reperfusion1h,whilemyocardialischemiareperfusionmodelwasestablishedbyligatingleftanteriordescendingcoronaryartery.TocontentofCK-MB,T-AOCandiNOSinserumwasdeterminedaccordingtothekit.TheproteinexpressionofLC3-Ⅱ,Beclin-1andmTORwasobservedbywestern-blot.Results:Autophagyinmyocardialischemiareperfusion1h.wasmoreseriousthanthatintheischemiaperiod.Comparedwiththemodelgroup,EGCGcouldeffectivelyimproveT-AOC,decreaseCK-MBandiNOS(P0.05).Meanwhile,EGCGdown-regulatedtheproteinexpressionofLC3-ⅡandBeclin-1,aswellasup-regulatedmTORproteinexpression(P0.05).Conclusion:Autophagyoccursinischemiathenenhancesduringischemia/reperfusionperiod.EGCGpreconditioninginhibitsautophagyinmyocardialischemiaandreperfusionperiod,furtherincreasesmyocardialantioxidantcapacityandreducesmyocardialischemiareperfusioninjury.[KEYWORDS]EGCG,myocardialischemiareperfusioninjury,autophagy自噬是一种广泛存在于真核细胞中的基本生命现象，其亚细胞膜结构发生变化并经溶酶体介导对细胞内蛋白质和细胞器降解的过程。心肌营养缺乏、缺血/再灌注损伤、心肌细胞肥大等均可诱发自噬[1]。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG）是从绿茶中提取的含量最高的儿茶素单体，植物来源丰富。以往对EGCG的研究主要集中在抗氧化、抗炎、逆转肿瘤多药耐药性方面[2]，近年有文献[3]表明EGCG对缺血再灌注损伤心肌有保护作用，但EGCG对自噬的影响未见报道。本研究建立大鼠心肌缺血及缺血/再灌注模型，研究EGCG调控自噬抗心肌缺血再灌注损伤的作用。1材料1.1实验动物SPF级SD大鼠，雌雄不拘，250-280g，购于桂林医学院实验动物中心（生产许可证：SCXK桂2009-0002）。1.2药物与试剂表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，纯度95%，大连美仑生物技术有限公司，货号：20111209），用生理盐水溶解备用；自噬阻断剂3-Methyladenine（3-MA，美国Cayman公司，货号：13242）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、总抗氧化力（T-AOC）、一氧化氮合酶（NOS）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；LC3-Ⅱ抗体（美国Epitomics公司，货号：ab52768）；mTOR、Beclin-1抗体均购于美国CST公司。1.3实验仪器BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；小动物呼吸机DW-3000（上海嘉鹏科技有限公司）；Model1450型自动酶标仪（美国BIORAD公司）；冷冻离心机MikRro220R（美国Beckman公司）；JY300C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；培清JS-780全自动凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司）。2方法2.1动物分组造模及给药将56只SD大鼠随机分为假手术、模型、EGCG（20mg/kg）、3-MA（15mg/kg）四组（n=8），各组于造模前20min.舌下静脉给药（假手术组及模型组给予同体积生理盐水），按文献方法[4]建立心肌缺血（缺血30min.）及缺血/再灌注损伤（缺血30min.再灌注1h.）模型。2.2指标检测及测定方法2.2.1血清T-AOC、iNOS及CK-MB含量测定造模结束，腹主动脉取血5ml，离心10min(3000pr·min-1)，吸取上清，按试剂盒说明书检测血清T-AOC、iNOS、CK-MB含量。2.2.2Western-blot检测LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR的蛋白表达取心脏，用预冷的生理盐水充分洗净残血，取部分结扎线以下左心室组织，滤纸吸干、剪碎、液氮研磨，用RIPA裂解液提取总蛋白，蛋白定量，进行SDS-PAGE电泳，转膜横流90mA，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗4℃过夜，二抗室温孵育1h，ECL发光，X光片显影、定影后用SensiAnsys凝胶图像分析系统测其灰度值。2.3统计学处理应用SPSS21.0统计软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用t检验，P0.05为有统计学意义。3结果3.1心电图结扎大鼠冠状动脉左前降支，导致大鼠心电图ST段明显抬高，说明造模成功，应用EGCG后ST段有所下降，说明EGCG对心肌有保护作用，见图1。图1大鼠心电图变化3.2血清生化指标检测从表1可见，模型组大鼠T-AOC明显降低，iNOS及CK-MB显著升高（P0.05vs.Sham）；与模型组相比，EGCG能改善心肌缺血及缺血/再灌注大鼠总抗氧化力，减少血清iNOS及CK-MB含量，其保护作用强于3-MA（P0.05或P0.01）。表1缺血30min.及缺血/再灌注1h.大鼠血清iNOS、T-AOC及CK-MB含量(x±s，n=8)GroupDose(mg/kg)iNOS(U/ml)T-AOC(U/ml)CK-MB(U/L)Ischemia30min.I/R1h.Ischemia30min.I/R1h.Ischemia30min.I/R1h.Sham/8.07±0.36**8.07±0.36**13.23±0.80**13.23±0.80**21.18±3.38**21.18±3.38**Model/13.14±0.3016.09±0.477.64±0.937.51±0.75176.04±9.91225.87±22.373-MA1511.57±1.27*13.38±0.68*8.72±0.53*8.89±0.79*152.31±7.46*172.46±15.17*EGCG208.43±1.21**9.54±1.13**12.12±1.46**12.18±1.51**73.33±11.33**84.87±8.04***P0.05,**P0.01vs.Model3.3心肌组织LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR蛋白表达与假手术组相比，模型组心肌组织LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达量显著增加，mTOR蛋白表达量显著降低（P0.05或P0.01）。与模型组相比，EGCG可明显降低LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达量，提高mTOR蛋白的表达，其作用效果比3-MA更明显（P0.05或P0.01）。BeforeligationAfterligationIv.EGCG结果见图2~4。图2大鼠心肌组织LC3-Ⅱ蛋白表达（*P0.05,**P0.01vs.Model）图3大鼠心肌组织Beclin-1蛋白表达（*P0.05,**P0.01vs.Model）LC3-Ⅱ16KDaGAPDH36KDaShamModel3-MAEGCGShamModel3-MAEGCG**********A缺血30minB缺血/再灌注1hBeclin-160KDaGAPDH36KDaShamModel3-MAEGCGShamModel3-MAEGCG************A缺血30minB缺血/再灌注1hmTOR289KDaGAPDH36KDaShamModel3-MAEGCGShamModel3-MAEGCG***********A缺血30minB缺血/再灌注1h图4大鼠心肌组织mTOR蛋白表达（*P0.05,**P0.01vs.Model）4结论自噬[5]是亚细胞膜结构发生变化并经溶酶体介导对细胞内蛋白质和细胞器降解的过程，通过形成自噬体降解其底物。LC3-Ⅱ和3-MA分别是公认的自噬标志物和自噬抑制剂[6]。自噬的发生机制、调控因素及药物干预是目前心肌缺血再灌注损伤研究的热点。多个研究表明自噬在MIRI中起“双刃剑”的作用[7-9]：缺血妻子是轻度增加，可抑制凋亡、促进细胞存活；但在再灌注期自噬异常增加，反而加重心肌损伤。本研究结果显示，EGCG能抑制再灌注自噬的发生，降低iNOS，提高T-AOC，减少心肌损伤标志物CK-MB的含量，保护心肌。自噬的调控主要通过两种途径[10-12]，一是mTOR介导的自噬/mTOR互反馈信号通路：在自噬初期，mTOR通过对自噬的负调控诱导自噬产生，促进细胞存活；自噬后期，mTOR则主要受PI3K-Akt-mTOR通路调节而被激活，抑制自噬。从图2~4中可见，在缺血期，EGCG虽然下调LC3-Ⅱ蛋白表达，但同时上调mTOR表达，在整体动物中可最终通