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课题3血红蛋白的提取和分离1、含量：占细胞干重的50％以上，是细胞中含量最多的有机化合物。2、组成元素：C、H、O、N3、基本单位：氨基酸蛋白质小知识氨基NH2COOH羧基HR—C—4、分子结构：氨基酸多肽蛋白质肽键：—CO—NH—5、相对分子质量：高分子化合物蛋白质小知识脱水缩合盘曲折叠1、分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。思考凝胶色谱法（分配色谱法）1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。性质：微小的多孔球体本质：多糖类化合物实例：葡聚糖、琼脂糖凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法（分配色谱法）2、原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量大小直径大小大于凝胶颗粒孔道直径小于凝胶颗粒孔道直径运动路径被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱次序先后缓冲溶液1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。3、配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。还记得人体血液中的缓冲液吗？H2CO3/NaHCO3NaH2PO4/Na2HPO4你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。电泳1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3、类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS：消除净电荷对迁移率的影响。电泳实验操作步骤样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定水分血浆固体物质血液白细胞血细胞血小板红细胞血红蛋白（90％）血红蛋白的组成ββαα血红素基因可携带一分子O2或一分子CO21、红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放3、分离血红蛋白溶液4、透析（一）样品处理问题：1、刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？加入抗凝血剂，防止血液凝固。2、怎样洗涤？采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次低速短时间离心生理盐水1、红细胞的洗涤3、洗涤的目的是什么？去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。4、洗涤干净的标志是什么？直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。1、红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放问题：加蒸馏水和甲苯的作用是什么？使红细胞破裂，释放出血红蛋白。有机溶剂（无色透明的甲苯层）脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）3、分离血红蛋白溶液高速离心－滤纸过滤－漏斗分液（二）凝胶色谱操作1、凝胶色谱柱的制作打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管2、凝胶色谱柱的装填固定色谱柱→配凝胶悬液→装填色谱柱→洗涤平衡3、样品的加入和洗脱调节缓冲液面→滴加透析样品→样品渗入凝胶床→洗脱→收集分装蛋白质2、凝胶色谱柱的装填固定色谱柱－配凝胶悬液－装填色谱柱－洗涤平衡磷酸缓冲液沸水浴加热紧密(pH为7.0)不得有气泡（二）凝胶色谱操作3、样品的加入和洗脱调节缓冲液面→滴加透析样品→样品渗入凝胶床→洗脱→收集分装蛋白质磷酸缓冲液(1)不要触及破坏凝胶面(pH为7.0)(2)贴壁加样(3)使吸管管口沿管壁环绕移动（二）凝胶色谱操作蛋白质的提取和分离步骤1、样品处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集血红蛋白溶液。2、粗分离经过透析去除分子量较小的杂质。3、纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白质除去。4、纯度鉴定通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。收集得到的纯化后的血红蛋白血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定问题：1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。