第41课时基因工程的基本工具和基本操作程序

第十单元现代生物科技专题第41课时基因工程的基本工具和基本操作程序高频考点突破考点一基因工程的概念理解和理论基础1.基因工程的概念理解(1)操作环境：体外——关键步骤“表达载体的构建”的环境。(2)优点①与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。②与诱变育种相比：定向改造生物性状。(3)操作水平：分子水平。(4)原理:基因重组。(5)本质:甲(供体提供目的基因)乙(受体表达目的基因),即基因未变、合成蛋白质未变,只是合成场所的转移。2.基因工程的基本原理和理论基础概括如下图提醒若题目强调“目的基因”的表达过程,则只包括“转录和翻译”两个过程,不包括目的基因的复制。对位训练1.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()①检测受体细胞中是否有目的基因②检测受体细胞中是否有致病基因③检测目的基因是否转录出了mRNA④检测目的基因是否翻译成蛋白质A.①②③B.②③④C.①③④D.①②④C2.科学家通过基因工程的方法，能使大肠杆菌产生人的胰岛素。以下叙述错误的是（）A.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达C.DNA连接酶和限制性核酸内切酶都是构建重组质粒必需的工具酶D.目的基因的检测与鉴定表达过程中没有发生碱基互补配对D考点二基因工程的操作工具1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)化学本质：蛋白质。(3)作用(4)作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。(5)切割方式催化作用,所以可重复利用可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端提醒①切割的化学键为磷酸二酯键。②在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。③将一个基因从DNA分子上切割下来,需要2个限制酶,同时产生4个黏性末端。④不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶产生的黏性末端不相同。2.DNA连接酶——“分子缝合针”常用类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端或平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键拓展提升DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键是否需模板不需要需要连接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上,形成磷酸二酯键作用结果将两个DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)类型提醒①质粒本质是DNA,不是细胞器;②特点:小型环状。(2)功能：将目的基因导入受体细胞。(3)应具备条件①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；②有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源基因连接；③有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定。最常用载体:质粒其他载体:λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等提醒①一般来说,天然载体往往不能满足人类的所有要求,因此人们根据不同的目的和需要,对某些天然的载体进行人工改造。②常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。③作为载体必须具有多个限制酶切点,而且每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别单一切点,若载体上有一个以上的酶切点,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制酶的一个切点,则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段,又不会丢失自己的片段。④注意与细胞膜上载体的区别,两者的化学本质和作用都不相同。⑤质粒能自我复制,既可在自身细胞、受体细胞也可在体外复制。对位训练3.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（）A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行连接B考点三基因工程的基本操作程序1.基因工程图解:抗虫棉的培育过程2.基本操作程序(1)目的基因的获取①从基因文库(基因组文库或cDNA文库)中获取文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种之间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性②人工合成目的基因:常用的方法有化学合成法和反转录法。化学合成法:蛋白质氨基酸序列RNA碱基序列DNA碱基序列用4种脱氧核苷酸人工合成目的基因反转录法:分离出供体细胞mRNA单链DNA合成目的基因分析推测推测逆转录酶DNA聚合酶③PCR扩增技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶、原料、引物不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制(PCR扩增仪)主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子(2)基因表达载体的构建——最核心步骤①基因表达载体的组成:启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。提醒①与载体相比较,增加启动子、目的基因和终止子三个基因片段,其功能各不相同。②启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA);终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。②基因表达载体的构建方法提醒该过程把三种工具(只有两种工具酶)全用上了,是最核心、最关键的一步,在体外进行。(3)将目的基因导入受体细胞细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞农杆菌转化法体细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上动物细胞显微注射技术受精卵将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物微生物细胞Ca2+处理增大细胞壁通透性原核细胞或酵母菌用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收提醒①唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。②微生物做受体细胞主要是个体微小,代谢旺盛,繁殖速度快,获得目的基因产物多。③植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。(4)目的基因的检测和表达对位训练4.下列有关基因工程技术的叙述,正确的是（）A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达C5.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（）A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D解题思路探究思维误区警示易错分析基因工程中易错点辨析不清(1)基因工程中有3种工具,但工具酶只有2种。(2)工具酶本质为蛋白质,载体本质为小型DNA分子,但不一定是环状。(3)标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基因,表达产物为带颜色物质等。(4)受体细胞中常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物——大肠杆菌、酵母菌等,但要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必需用真核生物酵母菌——需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟红细胞,原因是它无细胞核,不能合成蛋白质。纠正训练1.(2009·浙江卷,3)下列关于基因工程的叙述,错误的是()A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达解析基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物;常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶;人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性,只有经过一定的物质激活以后,才有生物活性。载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞,不能促进目的基因的表达。所以D错误。答案D2.(2009·重庆卷,2)下表有关基因表达的选项中,不可能的是()基因表达的的细胞表达产物A细菌抗虫蛋白基因抗虫棉叶肉细胞细菌抗虫蛋白B人酪氨酸酶基因正常人皮肤细胞人酪氨酸酶C动物胰岛素基因大肠杆菌工程菌细胞动物胰岛素D兔血红蛋白基因兔成熟红细胞兔血红蛋白解析细菌抗虫蛋白基因可通过转基因技术转入棉花体内,在棉花的叶肉细胞中表达产生细菌抗虫蛋白,使棉花具有抗虫能力;人酪氨酸酶基因可在正常人的皮肤细胞中表达产生酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素;动物胰岛素基因可通过转基因技术转移到大肠杆菌体内,在大肠杆菌工程菌细胞中合成动物胰岛素;兔属于哺乳动物,其成熟的红细胞中没有细胞核,所以不可能表达出血红蛋白。答案D3.(2009·安徽卷,4)2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。如果将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因,再将该融合基因转入真核生物细胞内,表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是()A.追踪目的基因在细胞内的复制过程B.追踪目的基因插入到染色体上的位置C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布D.追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构解析将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因,将该融合基因转入真核生物细胞内,表达出的蛋白质带有绿色荧光,从而可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布。故C正确。答案C知识综合应用重点提示通过“抗虫作物培育过程的有关基因工程知识”的考查,提升“综合运用所学知识解决自然界和社会生活中有关生物学问题”的能力。典例分析(2009·江苏卷,34)苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因),据图回答下列问题。(1)将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后,反应管中有种DNA片段。(2)图中②表示HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程,此过程可获得种重组质粒;如果换用BstⅠ与BamHⅠ酶切,目的基因与质粒连接后可获得种重组质粒。(3)目的基因插入质粒后,不能影响质粒的。(4)图中③的Ti质粒调控合成的vir蛋白,可以协助带有目的基因的T-DNA导入植物细胞,并防止植物细胞中对T-DNA的降解。(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体,使细胞膜穿孔,肠细胞裂解,昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小,原因是人类肠上皮细胞。(6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种,其目的是降低害虫种群中的基因频率的增长速率。解析本题重点考查转基因技术的相关知识,需特别注意基因工程的步骤、DNA的复制、基因工程的操作工具等知识。本题需特别注意图示过程,从中获取有效信息,然后结合课本知识即可正确解答。答案(1)4(2)21(3)复制(4)DNA水解酶(5)表面无相应的特异性受体(6)抗性定时检测组题说明特别推荐综合应用题——1、3；知识拓展提升题——2、6、8。考点题号基因工程的工具1～8基因工程的步骤1.(2009·福建理综,32)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点。请回答:(1)