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安徽理工大学医学院SchoolofMedicine教案首页第次课授课时间年月日教案完成时间：年月日课程名称免疫学检验年级专业、层次医学检验（本科）教师张荣波专业技术职务授课方式（大、小）大学时4授课题目（章、节）第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术基本教材或主要参考书教学目的和要求：1、掌握McAb及基因工程抗体的概念；杂交瘤技术的基本原理及HAT培养基的筛选机制；2、熟悉制备单克隆抗体的基本技术；3、了解单克隆抗体技术的研究进展；基因工程抗体的制备技术。大体内容与时间安排，教学方法：第一节杂交瘤技术的基本原理1学时第二节单克隆抗体的制备技术1学时第三节基因工程抗体技术2学时教学重点、难点：重点：熟悉制备单克隆抗体的基本技术；基因工程抗体的制备技术。难点：杂交瘤技术的基本原理及HAT培养基的筛选机制教研室审阅意见：（教研室主任签名）年月日1（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配备注由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，为单克隆抗体（McAb）。其理化性状高度均一，抗原结合部位和同种型都相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，有效抗体含量高，无效蛋白含量少，易于实验标准化和大量制备。单克隆抗体在医学领域中有广泛的应用。基因工程抗体(geneticengineeringantibody)又称重组抗体，在充分认识Ig(immunoglobulin)的基因结构和功能基础上，应用DNA重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对编码Ig分子基因进行切割、拼接与修饰等，并导入受体细胞，使之表达出新型抗体分子。该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，减少或去除了无关结构，更接近人的Ig，具有更广泛的应用前景。第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特征。当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体(heterokaryon)，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞(hybidcell)，包括B淋巴细胞杂交细胞和T淋巴细胞杂交细胞。一、B淋巴细胞杂交瘤技术该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。前者的主要特征是它的抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者则可在体外培养无限分裂增殖，二者杂交融合，形成在体外无限增殖分裂并产生McAb的杂交瘤细胞。其原理如下：（一）细胞的选择与融合融合细胞一方为经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞；另一方则是具有永生性的肿瘤细胞，选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。浓度为40％(W／V)的聚乙二醇PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂。（二）选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理过程。经融合过程后细胞将有多种形式出现，须进行特别的筛选得到融合的脾细胞与瘤细胞。HAT培养基应用原理：细胞的DNA合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进一步合成DNA。叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂。当氨基蝶呤存在时，能阻断瘤细胞核酸（DNA）合成的主要途径。2（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配备注细胞融合的选择培养液有三种关键成分：次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)，所以三者取前缀缩写为HAT培养基。而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选择出来的HGPRT阴性细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传特性，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。（三）有限稀释与抗原特异性选择在细胞融合后，须经筛选去除无关细胞融合体。一是融合细胞的抗体筛选，将融合细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一个孔中的细胞数在理论上是一个，实际可能是0至数个，培养后取上清液以ELISA筛选出特异性抗体高分泌性细胞，这一过程称为克隆化；二是将这些阳性细胞株再克隆化，以ELISA重复检测，将阳性孔细胞株进行增殖，再进行冻存，体外培养或动物腹腔接种。二、T淋巴细胞杂交瘤T淋巴细胞杂交瘤主要分为小鼠T细胞杂交瘤和人T细胞杂交瘤，由于T细胞功能的多样化，制备出的T细胞杂交瘤也各有其特性。如有可分泌各种淋巴因子的T细胞杂交瘤；具有特异性杀伤功能的T细胞杂交瘤；能够分泌T细胞抑制因子的特异性T细胞杂交瘤及自身反应性T细胞杂交瘤等。其基本过程是将激活的T细胞与酶缺陷型T淋巴瘤细胞融合，通过有限克隆稀释，可获得特异性表达T细胞受体(TCR)或其他功能的杂交瘤T细胞。在技术要求上，其细胞融合、培养过程和T细胞胞杂交瘤的建立，基本上与相应的B细胞杂交瘤技术相同。所不同的是细胞激活和阳性克隆筛选较为复杂，T细胞杂交瘤的稳定性不及B细胞杂交瘤，使其技术和应用受到限制。主要步骤如下：1．淋巴瘤细胞系的选择作为融合用的瘤细胞要求有以下特性：①在体外能无限、快速生长；②融合率高；③不分泌淋巴因子和杀伤功能；④缺乏某一特异性的T细胞表面抗原或受体；⑤HGPRT酶缺陷型等。2．特异性T细胞的制备与活化主要有可溶性抗原诱导激活的T细胞、同种反应性T细胞和人的特异性T细胞等。3．T细胞杂交瘤的筛选通常在含有HAT选择培养的基础上，亦可根据融合两亲本细胞特性选用不同的方法。3基本内容辅助手段和时间分配备注三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养为确保单克隆抗体的专一性及避免其他阴性细胞对其生长的影响，必须将阳性的杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，产生单克隆杂交瘤细胞，经反复2～3次检测上清液均为阳性的杂交瘤单个细胞才能进行克隆化培养。克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞应当及时冻存，以防止这些细胞染色体丢失、发生变异以及细胞污染。冻存时保存液中小牛血清浓度为20％，再加入10％的二甲基亚砜，最好保存在-196℃液氮中。第二节单克隆抗体的制备技术杂交瘤技术制备McAb的三个基本原则：淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆产生一种抗体；杂交瘤细胞保持双方亲代细胞的特性；利用代谢缺陷补救机制筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的各种McAb。一、单克隆抗体的产生（一）动物体内诱生方法为人体治疗、体外诊断或实验研究用单克隆抗体多采用该制备方法。先在小鼠腹腔注射液体石蜡或弗氏不完全佐剂，1周后将杂交瘤细胞悬液注射腹腔，1～2周后无菌方法抽取腹水，离心取上清液即可。（二）体外培养法这是实验室常用的McAb制备方法。将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，收集上清液，这种方法制备的McAb极为有限，但可满足绝大多数的免疫学实验要求。另一种方法是杂交瘤细胞大量培养，有两种类型，一类是悬浮培养系统；另一类是细胞固定化培养系统。高密度培养可使单位体积McAb含量明显增加，操作简便，不受动物干扰，价格便宜，有取代动物体内诱生的趋势。二、单克隆抗体的纯化目前常用的纯化方法有：盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等方法达到纯化目的，也有采用较简便的酸沉淀法。最有效的纯化法为亲合纯化法，常用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联，制备亲合层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可超过90％。三、单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体分离纯化后的鉴定方法可包括：夹心型的放射免疫测定、补体介导的溶血试验、ELISA、免疫酶染色以及玫瑰花结形成试验等。亦可用沉淀试验和凝聚试验。现以ELISA方法最常用。4基本内容辅助手段和时间分配备注第三节基因工程抗体技术随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学的深入研究，应用基因工程抗体改造现有优良的鼠单克隆抗体的基因，尽量减少抗体中的鼠源成分，保留原有的抗体特异性，从而创造出新型抗体．基因工程抗体。一、人源化抗体人源化抗体以基因克隆及DNA重组技术改造将鼠源性单克隆抗体使其大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既保留了亲本鼠克隆抗体的亲合力和特异性，又降低了鼠单克隆抗体的异源性。(一)人一鼠嵌合抗体人一鼠嵌合抗体是通过基因工程技术将人IgC区与鼠IgV区连接，导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体。人一鼠嵌合抗体的特异性及亲合力与亲本鼠单克隆抗体等同，但在人体内的半衰期可明显延长。(二)抗体的表面修饰通过改变Ig可变区表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源性。将亲本鼠单克隆抗体Fv段表面暴露的骨架区中与人不同者改为人源性，使Fv的表面人源化，消除其免疫原而不影响Fv的整体空间构象。二、小分子抗体将抗体分子的抗原结合部位组建成分子量较小，但具有抗原结合功能的分子片段，称为小分子抗蠢小分子抗体具有以下特点：可在大肠杆菌等原核细胞表达生产成本降低；易于穿透血管或组织到脚胞部位，有利于疾病的治疗；不含Fc段，副作用小；半衰期短，有利于毒素中和及清除。其包括：（一）Fab由一条完整的L链和一条约1/2的H链组成，只有一个抗原结合位点。（二）Fv和单链抗体（ScFv）Fv由VH和VL构成，是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段。把VH和VL用一段适当的寡核苷酸分子连接起来，使之表达为单一的肽链，称为ScFv。（三）单区抗体及最小识别单位单独重链可变区（VH）仍可保留相当程度抗原结合能力，其作用比VL大，称为单区抗体。5（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配备注三、抗体融合蛋白将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到具有多样性生物功能的融合蛋白，并有多种不同的构建方式。（一）含Fv段的抗体融合蛋白将Fv与某些毒素、酶及细胞因子等的基因拼接，通过这些抗体的引导可将其生物活性物质导向靶细胞特定的部位，更有效地在局部发挥生物学功能而降低毒副反应。(二)嵌合受体将ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表达于细胞表面，称为嵌合受体，其抗体部分与相应抗原特异性结合。(三)含Fc的抗体融合蛋白将功能性蛋白分子细胞膜外部分与Fc融合后用真核细胞表达，其融合蛋白能以Ig类似的方式由二硫键连接成双体，分泌到细胞外。这种功能性蛋白分子与抗体Fc的融合可产生两种效果：延长在血循环中的半衰期；通过功能性蛋白与配体分子的作用，将Fc的生物学效应引导至特定目标。四、双特异性抗体通过基因工程技术构建的小分子抗体为单价，不能使抗原抗体偶联，将特异性不同的两个小分子抗体连接在一起则可得到双特异性抗体(BsAb)。(一)双特异性抗体的构建1．双特异性抗体片段的体外构建在小分子抗体的羧基端设计半胱氨酸残基，两个不同抗体段通过此连接可生成双特性抗体或称为双功能抗体。2．双特异性抗体的细胞内组建通过对小分子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双抗体分子。目前可采用几种方法：设计促进双聚体形成的结构域；在基因构建上直接将两个抗体分子片段融合；设计两个ScFv的VH和VL相互配对，可产生双价的抗体分子等。(二)双特异性抗体的应用1．在免疫检测中的应用双特异性抗体的一个臂结合靶抗原，另一个臂结合酶，应用于酶免疫检测中，操作简化，质量提高。6（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配备注2．在肿瘤放射免疫显像中的应用双特异性抗体一个臂结合肿瘤细胞表面抗原，另一个臂结合半抗原螯合剂，后者选择与放射性核素结合，利用二次导向系统，增加了清晰度和灵敏度。3．双特异性抗体介导的药物杀伤效应该抗体以抗原抗体反应替代了化学偶联。具有定位准，疗效增高的特点。4．双特异性抗体介导的细胞杀伤效应该抗体其一臂结合靶细胞表面抗原，另一臂不但结合免疫活性细胞起介导作用，而且能激活免疫细胞。五、抗体库技术及其应用抗体库技术是指用基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因克隆出来，重组到质粒表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，最后筛选特异的可变区基因。抗体库技术的成功与PCR技术的成熟和能成功利用大肠杆菌表达分泌性抗体分子片段有关。（一）组合抗体库技术组合抗体库技术要点：采用RT-PCR技术从淋巴细胞克隆出全套抗体轻链基因和重链基因，将二者分别组建到表达载体中，得到轻链基因库和重链Fab段基因库，再通过DNA重组技术将轻链基因和Fab段随机重组于一个表达载体中，即形成组