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第九章动物基因工程基因工程技术由细胞水平发展到动物整体水平，人们可以将单一功能基因或基因簇引入高等动物的染色体DNA中，实现了种系内和种系间的基因转移，并由此构建出各种转基因动物。动物基因工程也由此分为动物细胞基因表达技术和动物转基因技术两个层次，前者主要利用动物工程细胞大规模生产蛋白多肽物质或作为药物筛选研究的体外（invitro）评价模型。而后者则通过转基因动物个体进行动物遗传性状的改良或作为药物筛选研究的体内（invivo）评价模型及人体的基因治疗。第一节动物细胞基因工程采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点：①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接加工成成熟的mRNA；②哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，加工后的蛋白质免疫原性好，约为酵母型的16~20倍；③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性；④经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。一、动物细胞表达体系动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部分组成。1表达载体目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载体有：（1）逆转录病毒（Retrovirus）载体（2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体（3）腺相关病毒（Adeno-associatedVirus，AAV）载体（4）质粒载体2宿主细胞虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着一些不足，因此，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿主细胞试用于真核细胞的表达系统中。（1）BHK-21细胞该细胞最早从地鼠幼鼠的肾脏分离，现在广泛应用的是采用单细胞分离技术经13次克隆的细胞。原始的细胞株是成纤维样细胞，并且具有贴壁依赖性，但经无数次传代后细胞可悬浮生长。（2）CHO-K1细胞该细胞是CHO细胞的一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr—）的营养缺陷突变株，它可以在氨甲蝶呤(MTX）压力下使外源基因的基因拷贝数扩增，使外源蛋白质得到较高水平表达。（3）C127细胞该细胞来自RIII小鼠乳腺肿瘤细胞，适用于带有牛乳头瘤病毒（BPV）载体的转染。当用BPV-1病毒载体转染后，细胞的生长形态可发生显著变化，因此转染成功的细胞可通过特有的转化形态加以识别。（4）MDCK细胞该细胞是从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得，是具有贴壁依赖性的上皮样细胞，已成功地在微载体上增殖。该细胞能支持多种病毒的增殖，已被用来生产兽用疫苗。（5）Namalwa细胞该细胞是一株人的类淋巴母细胞,来自名为“Namalwa”的Burkitt淋巴瘤患者，含有部分疱疹病毒基因，但不产生疱疹病毒。该细胞已被批准用于大规模生产α干扰素，可以用无血清培养基在悬浮状态下高密度培养，可有效地表达外源基因。（6）Vero细胞该细胞是从正常的成年非洲绿猴肾分离获得的，一株具有贴壁依赖性的成纤维细胞。可持续地进行细胞培养，并可支持多种病毒的增殖并制成疫苗。（7）鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞是“专业”的分泌细胞，在培养上清中可产生高达100mg/L的免疫球蛋白（Ig），而且容易转染，容易生长，可在无血清培养基中高密度的悬浮培养；能对蛋白质进行糖基化修饰；高效表达Ig基因的调控成分明确，有利于表达载体的增强子和启动子的合理设计。（8）COS细胞该细胞是利用复制起点缺失的SV40转染非洲绿猴肾细胞CV-1而获得，具有COS-1、-3、和-7三个细胞系。由于COS细胞来源广，易培养，易转染；能组成性表达SV40大T抗原，能使大多数哺乳动物细胞携带有复制子的质粒以附加体形式高拷贝扩增；大量扩增的质粒及其高表达的mRNA和蛋白质，容易回收和分析，因此被广泛地用于瞬时表达系统。二、动物细胞表达载体的构建目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰效率的影响。构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑。下面分别从转录水平和翻译水平的调控元件、整合位点的优化以及增加目的基因拷贝数等方面对此作一介绍。1.转录水平在目的基因拷贝数一定，整合位点固定的情况下，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个高效表达载体的构建来说显得尤为重要。启动子及其相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素。在转录过程中，转录因子通过DNA结合结构域特异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启始基因的转录和表达。因此，提高宿主细胞转录因子的表达水平也能增强目的基因的表达。2.翻译水平除了转录水平的调控外，翻译水平的调控和翻译产物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要的影响。Ploy（A）的存在不但能影响mRNA稳定性，而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高mRNA翻译水平；内部核糖体进入位点（IRES）能使同一mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达；翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏好的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大幅度提高翻译效率。3.整合位点的优化目的基因在细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。因此，保证将表达载体整合在细胞染色体上转录活跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需的一步，主要通过以下几种策略实现。一是通过选择基因（如neo、dhfr）的弱化表达；二是在载体上添加染色体上的某些特定序列，使表达载体整合到宿主细胞的染色体后能模拟染色体的高转录活跃区；三是先将含有定点重组位点的选择标记基因整合在染色体高表达区，然后将表达目的基因的表达载体和表达重组酶载体共转染上述带有重组位点的细胞系。4增加目的基因拷贝数单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何优化、整合的染色体位点多么合适，其外源基因表达量都是有限的。因此，通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的工程细胞株是基因工程药物研究中不可或缺的一步。目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共扩增的方法，三、动物细胞转化方法与筛选1基因的导入方法在真核细胞的表达研究中，细胞转染是一个关键步骤。在基因治疗中，也需要用基因转移技术导入外源基因。因此该技术的研究已越来越受到重视，至今已开发了许多新的技术和方法。不同的细胞系，摄取和表达外源DNA的能力可相差几个数量级。因此如果采用某种特定的细胞系，就务必比较几种不同方法的效率。当前用于DNA转染哺乳动物细胞的主要方法见下表。真核细胞转染方法方法优点缺点物理方法光穿孔简单，细胞伤害小需专门仪器冲击波简单，可能用于临床需专门仪器基因枪很有效需专门仪器电穿孔适用于悬浮细胞需专门仪器显微注射很有效技术困难化学方法磷酸钙共沉淀法简单不适合悬浮细胞脂质体法简单，很有效不适合悬浮细胞二乙铵乙基葡聚糖简单仅用于瞬时表达生物学方法反转录病毒法很有效宿主范围限制原生质体融合法适合悬浮细胞结果不稳定（1）光穿孔法光穿孔法（optoporation）是利用激光产生的热量，使细胞壁产生孔洞，将外源物质导入细胞。（2）冲击波法冲击波法（shockwavepermeabilization）是利用细胞受冲击后细胞膜通透性瞬时增加，使外源基因导入细胞。（3）基因枪法基因枪（genegun）法又叫微粒轰击法、生物发射技术或高速微粒子发射技术。通过提供给包裹有DNA的微小金颗粒(或钨粉)很高的初速度，使其穿透植物细胞壁而达到转移外源质粒子DNA的目的。（4）电穿孔法电穿孔(Electroporation)是指在高压脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，从而导致不同细胞之间的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。（5）磷酸钙转染法磷酸钙转染法（calciumphosphateco-precipitation）是把含外源基因的质粒或已克隆化的基因作为转染物，与磷酸钙转染液混合，加入到宿主细胞的培养环境中，在磷酸钙转染液的媒介下能使转染的DNA被整合到受体细胞的基因组中。（6）二乙铵乙基葡聚糖介导法该方法是带正电的二乙铵乙基葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞。（7）脂质体法脂质体（liposomeencapsulation）是由天然脂类和类固醇组成的微球，脂质体转染法可能的机理是阳离子脂质体与带负电的基因依靠静电作用形成脂质体基因复合物，该复合物因阳离子脂质体的过剩正电荷而带正电，借助静电作用吸附于带负电的细胞表面，再通过与细胞膜融合或细胞内吞作用而进入细胞内，脂质体基因复合物在细胞质中可能进一步传递到细胞核内释放基因，并在细胞内获得表达。（8）抗体转染法利用抗体作为载体，介导基因进入表达特定表面抗原细胞的方法为抗体转染（antifection）。（9）其他其他有超声波法，它的生物学效应是空化作用，超声过程中形成的真空气旋在塌缩时产生局部高温、高压使气泡周围的细胞受到影响，细胞膜发生可逆的通透性变化。其他外源DNA导入动物细胞的方法还有，微注射法（microinjection）、原生质体融合法（protoplastfusion）和病毒感染法（viralinfection）等。2哺乳动物基因转移的遗传选择标记（1）胸苷激酶基因（tk）选择系统胸苷激酶(thymidinekinase)是核苷酸合成代谢途径中的一种酶，能将胸苷转换成为胸苷-磷酸。在胸苷激酶基因选择系统中，必须用tk表型缺陷型(tk-)细胞株作为宿主细胞。由于选择tk+细胞的培养基含有次黄嘌呤(hupoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)，所以叫做HAT选择法。其选择原理为：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤(A)处理细胞，二氢叶酸还原酶被抑制，不能使二氢叶酸还原成四氢叶酸，其结果是培养基中的四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成TTP以及dATP和dCTP的合成过程均被阻断。次黄嘌呤是dATP和dACP补救合成途径的一种底物，培养基中含有这种物质时，细胞就能越过氨基蝶呤的抑制作用，利用补救途径继续合成出这些核苷酸。（2）二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统DHFR-MTX高效表达系统外源基因dhfr转染dhfr-细胞系单克隆培养转移0.05mMMTX(氨甲喋呤)培养单克隆转移培养单克隆转移5mMMTX0.25mMMTX培养单克隆外源基因扩增至100拷贝（3）新霉素抗性选择系统新霉素是细菌抗生素，它可以干扰原核生物的核糖体，使其蛋白质合成不能正常进行，新霉素的一种类似物G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞均有毒性。细菌的新霉素抗性基因(neo)能在真核细胞中表达，当neo基因与能有效转录的真核DNA序列连锁时就能获得有效的表达。Neo基因编码一种磷酸转移酶，这种酶能使G418失活。所以，当细胞表达了这种neo抗性基因后，就会在含G418的选择培养基中存活，这种选择系统适用于所有的细胞类型。第二节转基因动物转基因动物（技术）是以动物个体作为基因受体的基因表达技术。目的基因导入动物体之后，其行为和表达调控与导入离体培养的动物细胞系有很大差别。所以，即使单纯出于研究目的，动物细胞系也不能替代转基因动物。一、转基因动物概念目前，对于转基因动物还没有一个简单而明确的定义。为了正确理解什么是转基因动物，在这里我们只强调所有转基因动物都是由于外源基因（包括同一物种的DNA）导入动物的基因组而产生了可以遗传的改变。这些可以遗传的改变包括：外源基因片段至少整合到一条染色体的一个位点上；外源基因的插入使基因组中任何一个基因的结构