第8章基因工程

第8章基因工程基因工程•1、基因工程？•在宿主细胞中克隆特定的基因并使其表达，以获得基因表达的产物，也可定向改造细胞或生物个体。•2、基因克隆？•又叫分子克隆。即将特定的DNA片段通过载体导入宿主细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝。•2、基因工程的意义•1)获得大量的有应用价值的酶：纤维素酶•2）得到有药用价值的生物制品：尿激酶•3）改造工业用微生物•4）可对一些疾病进行基因治疗•3、基因工程的基本环节•1）目的基因的获得•2）目的基因克隆•3）导入宿主细胞•4）表达原核基因工程各环节浅析•1、目的基因的获得•1）提取基因组DNA，经PCR扩增获得•2）提取总RNA，经RT-PCR获得•3）化学合成•4）从基因组文库或cDNA文库中调取•2、DNA重组•1）DNA分子重组技术•在体外把特定的DNA片段插入核酸载体中并形成磷酸二酯键连接，从而组合成一个新的DNA分子。•2）载体：基因的渡船•一个可结合特定DNA片段并把它转运进细胞中的物质。常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。•载体的特点•①能在宿主细胞中复制繁殖，复制能力越高越好。•②容易进入宿主细胞，效率越高越好。•③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。•④容易从宿主细胞中分离纯化出来•⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。••克隆载体为了基因克隆而用于携带DNA片段进入宿主细胞的自动自我复制的遗传成分。常用的载体是细菌质粒与修饰过的噬菌体基因组。•常用的克隆载体：•1）质粒（10kb)•2）λ噬菌体(9-23kb)：以多克隆位点与筛选标记代替费必需区。•3）粘性质粒(40-50kb)：带有cos区的载体•表达载体携带基因或cDNA进入恰当的宿主细胞,并引导编码蛋白合成的经修饰的质粒或病毒。一般带可被宿主细胞识别的有基因表达调控元件：启动子，核糖体结合位点，转录终止序列。质粒载体•常用的重组方法•1）粘性末端连接•2）加上同聚体的尾部•3）加人工接头•4）平末端连接目的基因与载体重组•3、把重组DNA导入宿主细胞•1)转化：将质粒或其他DNA导入宿主细胞，并使其获得新的表型。•采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。•例：冷CaCl处理制备感受态细胞•用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法•2）感染：噬菌体感染细菌•3）转染：重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。•4、转基因后的鉴定•1）根据重组载体的标志作筛选•2）核酸杂交法•3）PCR法•4）DNA限制性内切酶图谱分析•5）核苷酸序列测定•6）基因的表达产物鉴定•免疫印迹（Western-blot）•克隆基因的表达•原核常用表达体系：大肠杆菌•E.coliori+抗性基因+E.coli启动子+SD序列+克隆位点+终止信号•表达产物•基因表达的鉴定非融合蛋白融合蛋白原核基因工程流程图提取基因组DNA或RNA目的基因的获得与载体重组导入宿主细胞克隆的筛选与鉴定表达产物的鉴定真核基因工程各环节浅析•1、目的基因的获得•2、DNA重组•表达载体：穿梭质粒E.coliori+抗性基因+真核启动子/增强子+克隆位点+终止信号+尾•DNA的扩增•重组质粒转化大肠杆菌，挑出成功的克隆，大量培养培养，获得重组的质粒。•导入真核宿主细胞•常用方法：•磷酸钙共沉淀•电穿孔•脂质体•显微注射法•克隆的筛选•导入成功克隆的筛选•1、抗性基因与药物筛选•G418与neor基因•2、绿色荧光蛋白•真核表达•常用的真核表达系统：•1、昆虫表达系统：例，果蝇S2细胞•2、杆状病毒表达系统：例，Sf9细胞系•3、酵母的表达系统•有些时候会采用哺乳动物细胞•基因表达的鉴定•mRNA的检测•蛋白的检测文献的阅读与分析