西北大学研究生科研实验资助项目申请书(新)doc1

年度编号研究生科研实验资助项目申请书项目名称用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速层析试纸条的研制申请人姓名王艳霞导师姓名崔亚丽学科专业生物化学与分子生物学申请人单位生命科学学院申请日期2010年10月9日西北大学研究生处二〇一〇年九月制1一、基本情况项目名称用于黄曲霉毒素定量检测的金磁微粒标记快速层析试纸条的研制姓名王艳霞学号200921017单位名称生命科学学院专业生物化学与分子生物学指导老师崔亚丽电话[phone]电子信箱[e-mail]学位论文题目纳米金磁微粒标记技术在快速定量检测黄曲霉毒素中的应用申请资助金额（元）0.5万元预计完成时间二年导师是否有配套资助资金是配套资助资金金额0.5万元二、项目依据本项目的理论意义和实践意义、项目创新点、国内外研究状况分析。黄曲霉毒素(Aflatoxins,简称AFT)是本世纪60年代初发现的由曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉所产生有毒代谢产物，它是一种肝脏毒素，是迄今为止发现的毒性最强的生物毒素之一，AFT同时具有致癌作用。1993年，世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构将其划定为一类致癌物。目前已经在粮食、油料作物的种子、干果、调味品、发酵产品和饲料内，甚至在酒类等多种农产品及制品中发现了AFT的存在。AFT是含有双呋喃环和氧杂萘邻酮的杂环化合物，已经发现的AFT有B1、B2、B2a、G1、G2、M1、M2、Q1、Q2a等17种之多，其中AFB1毒性最强。目前建立的针对AFT的检测方法主要有：薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法、免疫亲和柱法和电化学法等。2其中高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法、免疫亲和柱法等亦可很好的完成定量工作，检测线可以达到6ppt。然而这些方法存在操作复杂、过程烦琐、检测时间长、劳动强度大，仪器设备昂贵、需要专门的技术人员等缺点。快速ELISA、免疫亲和柱-荧光计法，电化学等方法同样需要配备相应的仪器设备。寻求快速、准确且经济可行的检测方法已成为AFT研究中亟需解决的任务之一。胶体金层析试纸法在定性检测方面具有简单、快速（3-5min）、灵敏(4ng/mL或更低)，无需仪器设备，可以很方便的在实验室、农场、饲料混合车间等多种场所进行实地测定。更重要的是，该方法检测成本低，便于广泛的推广和应用，在AFT检测方面具有广阔的应用前景，但该方法依然存在不能实现定量检测的缺点。核壳型磁性纳米微粒是一种金包被的Fe3O4纳米粒子，该微粒中的Fe3O4具有超顺磁性，表面包被的金又具有纳米金的光学性质；其表面经过功能化修饰后，金磁微粒具有良好的分散性和在缓冲液中抗团聚能力，同时末端的功能化基团能偶联各种生物大分子（特定的核酸片段、抗体、抗原等）。这些特性使该磁性纳米微粒可以很好的用于医学领域和生物分子的定性定量检测；既方便快捷，又可实现可目视化。本研究正是充分利用了纳米金磁微粒的这些特性，用纳米金磁微粒代替胶体金，研制金磁微粒标记快速层析检测试纸条，实现对黄曲霉毒素的定性以及定量测定。该方法既可克服胶体金层析试纸不能定量的缺陷，又具有试纸检测的巨大的优越性，具有广阔的应用前景。3三、研究基础1.近期已取得的与本项目有关的主要研究成果1.近期已取得的与本项目有关的主要研究成果在本实验室已有工作的基础上，对合成的核壳型磁性纳米微粒进行表面功能化修饰，得到了具有纳米光学效应的超顺磁性纳米金磁微粒，以下是相关的研究结果：（1）合成得到纳米级金磁微粒，其TEM照片及表面Zeta电位的检测结果如下：（2）具有较高稳定性的纳米金磁微粒，具备特有的光学效应，结果如图所示：Zatapotential：40.5mv3003504004505005506006507007500.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50wavelengthAbsorbance1TrisHCl1XPBS10XPBSPBSTgoldmag4在经过不同方式处理后的纳米金磁微粒，具有特有的颜色，照片如下图所示：由于纳米级金磁微粒兼有超顺磁性以及胶体金的光学性质，该材料是分子检测的良好的标记材料，通过前期的摸索实验，已经能够用在检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)，检测结果如下图所示：52.已有研究条件生物化学与分子生物学专业依托国家微检测系统工程技术研究中心，中心以集成生物学、化学、材料学、精密机械加工、光电子检测等领域的前沿技术和多学科交叉为特点，通过装置微型化，实现生物医药领域微量化检测的高度集成。中心现有工程技术研究人员六十余人（包括9位海外专家），培养及共同培养博士、硕士近60人，微检测领域技术带头人10人。已建成微阵列系统、纳微米磁性材料、细胞色素酶P450药物筛选和个体化用药、人血液代用品等技术平台。承担国家“十五”“十一五”863重大专项等国家级项目十余项。开发出了多项具有自主知识产权的新产品和新技术，包括四大类50余种新产品和新仪器设备。申请专利60余项，获授权20项（美国专利1项）。“磁性复合微粒及其在生物医学领域中的应用”获2004年陕西省科学技术进步一等奖。目前已同国内外三十多家科研机构与企业形成广泛合作，建立了具有创新发展能力的微检测系统研发体系和产业雏形。本课题组经过13年的努力，已研制出具有自主知识产权和功能独特的新型磁性微粒，在已有的具有自主知识产权的成果基础上，项目组对原始技术不断的进行应用创新和产品开发，结合胶体金表面生物分子可修饰性和磁性纳米粒子超顺磁性双重特质，将单质金还原在磁性氧化物粒子表面，发明了核壳型Fe3O4/Au磁性微粒；在修饰有功能团的氧化物粒子表面组装纳米金，发明了组装结构的Fe3O4/Au磁性微粒，项目组将上述两种微粒命名为金磁微粒（GoldMagParticles）；该成果已获授权专利11项，其中美国发明专利1项，中国发明专利9项，实用新型专利1项；针对新型磁性微粒合成和应用产品的拓展升级，申请了中国发明专利21项，其中已公开11项，围绕核心技术原始创新和应用产品集成创新的专利群已经形成；在国内外发表相关论文40余篇，纳米金磁微粒的光学性质及应用研究还有许多值得开展研究的工作。6四、研究方案项目研究内容、研究思路、实验方法（包括重点难点、解决途径）等。本项目的内容包括：1、对合成的核壳型磁性纳米微粒进行表面功能化修饰1）酸处理去除纳米金磁微粒未包裹的氧化物粒子（通过实验已基本掌握了酸处理除去氧化物粒子的条件）。2）将酸处理后核壳型纳米金磁的表面功能化修饰，主要原理就是Au与SH-的反应使纳米金磁表面带有一层功能基团使其具有很好的分散性和具纳米金光学性质，同时在PBS，生理盐水的条件下不发生团聚，能更便于偶联生物分子而仍然具有好的分散性和光学性质（这一部分内容通过实验已经基本获得了非常好的实验结果。2、AFB1完全抗原的制备1）优化乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC）法制备AFB1完全抗原的条件。2）AFB1完全抗原的鉴定与评价：包括测定抗原浓度、纯度和特异性以及蛋白偶联率。3、金磁标记抗体层析试纸条检测黄曲霉毒素1）金磁标记抗体的制备：优化金磁标记抗体的条件和优选最佳的标记抗体稀释液，以保证标记抗体在试纸条上顺利展层。2）试纸条的组装：优选试纸条组件材料，并以适宜的结合垫处理液处理结合垫。然后按一定的规格组装试纸条。金磁标记试纸条检测黄曲霉毒素的原理如下：72）检测检测线和质控线同时出现红色条带，则样品呈未出现条带，试纸条检测结果无效。3）确定试纸条的检测限以及阴性。如果仅质控线出现红色条带，样品呈阳性。如果质控线对试纸条使用效果的进行初步评价与ELISA法、HPLC法进行比较并确认同时测试试纸条的特异性、稳定性。4）通过磁信号对试纸条上的黄曲霉毒素进行定量检测，这是金磁标记试纸条最突出的优点，既定性又定量。通过以上方法进行黄曲霉毒素的检测能够比胶体金层析试纸的检测方法更灵敏同时做到定量检测。通过对核壳纳米金磁微粒的表面功能化修饰能克服纳米金在不同缓冲液中发生团聚而影响后续的生物分子的检测，同时具有功能化的末端（如羧基末端）的金磁微粒能够比纳米金更快速牢固的偶联生物分子。具有磁性的Fe3O4且不需要高速离心仅需要磁性分离架就能快速方便完成偶联不同的生物分子。并且具有金壳层的表面保持了纳米金特有的光学性质，从而实现了对黄曲霉毒素的快速定量检测。为检验新方法的建立奠定基础。参考文献：[1]Hye-YoungPark,†MarkJ.Schadt,LingyanWang,I-ImStephanieLim,PeterN.Njoki,SooHongKim,Min-YoungJang,JinLuo,andChuan-JianZhong.FabricationofMagneticCore@[e-mail]2007,23,9050-9056[2]AnandGole,JohnW.Stone,WilliamR.Gemmill,Hans-ConradzurLoye,andCatherineJ.Murphy.IronOxideCoatedGoldNanorods:Synthesis,Characterization,andMagneticManipulation[3]D.Caruntu,B.L.Cushing,G.CaruntandC.J.O’Connor,AttachmentofGoldNanograinsontoColloidalMagnetiteNanocrystals.Chem.Mater.,2005,17,3398~3402.[4]CreightonET.1990.DarkfieldmicroscopyforthedetectionandidentificationofTreponemapallidum,p.49-62.InS.A.Larsen,E.F.HunterandS.J.Kraus(ed.),Amanualoftestsforsyphilis.AmericanPublicHealthAssociation,Washington,D.C[5]NicholsHJ,HoughWH.DemonstrationofSpirochaetapallidainthecerebrospinalfluid[J].JAMA.1913,60:108-110[6]ParkerW.B.，Cheng，Y.C.Metabolismandmechanismofactionof85-fluorouracil[J].Pharmacology&therapeutics，1990，V48(33):381-395[7]Ambrosi,A.,Castaneda,M.,Killard,A.,Smyth,M.,Alegret,S.,Merkoci,A.,2007.Anal.Chem.79,5232–5240.[8]Burke,A.,Yilmaz,E.,Hasirci,N.,2000.Turk.J.Med.Sci.30,341–348.Cervino,C.,Weber,E.,Knopp,D.,Niessner,R.,2008.J.Immunol.Methods329,184–193.[9]Fremy,J.,Usleber,E.,2003.J.AOACInt.86,868–871.[10]Goryacheva,I.Y.,DeSaeger,S.,Eremin,S.A.,VanPetheghem,C.,2007.FoodAddit.Contam.24,1169–1183.[11]Kang,Y.S.,Risbud,S.,Rabolt,J.F.,Stroeve,P.,1996.Chem.Mater.8,2209–2211.[12]Kolosova,A.Y.,DeSaeger,S.,Sibanda,L.,Verheijen,R.,Van