贝伐珠单抗在肿瘤治疗中的应用

生命科学学院课程论文(作业)封面（2015至2016学年度第2学期）课程名称：基因工程制药课程编号：09600088Z学生姓名：李超学号：A09130274班级：制药1301任课教师:吴云舟提交日期：年月日评阅日期：年月日成绩贝伐珠单抗在肿瘤治疗中的应用李超（东北农业大学，生命科学学院）摘要：贝伐珠单抗是一种重组人源化免疫球蛋白G1单克隆抗体，可通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）活性及抗血管生成，达到抑制肿瘤生长的目的，目前已广泛用于结直肠癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤的治疗，尤其是通过与基础化疗结合，能显著提高治疗的有效率以及延长肿瘤患者的无进展生存期和总生存期。本文主要介绍贝伐珠单抗制备原理过程，治疗肿瘤的机制，及该类药物未来的发展。关键词：贝伐珠单抗；制备过程；VEGF；抗肿瘤1.引言癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，预防和治疗癌症也是研究和开发抗体药物的主要目标之一。目前在临床中使用的肿瘤治疗药物多数存在“敌我不分”的问题，即在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了人体正常细胞。“生物导弹”为解决这个难题提供了一个理想的思路。这种药物经由静脉注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又减少对机体的毒副作用。单克隆抗体由于具有良好的均一性和高度的特异性，因而在癌症治疗领域中得到了广泛应用。结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。我国结直肠癌在男女常见的恶性肿瘤中分别排名第5和第6，结直肠癌导致的死亡占所有肿瘤的5.6％。近年来，随着单抗药物的开发，抗血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)药物在抗肿瘤领域的有效应用，使结直肠癌患者死亡率显著降低。贝伐珠单抗是罗氏的重磅治疗转移性结直肠癌的药物，属于人源化抗-VEGF单克隆抗体。贝伐珠单抗于2004年获美国FDA批准上市，商品名为“阿瓦斯汀”。其治疗直肠癌的机理是通过与血管内皮生长因子(VEGF)特异性结合，阻止其与受体相互作用，发挥对肿瘤血管的多种作用，使现有的肿瘤血管退化，从而切断肿瘤细胞生长所需氧气及其他营养物质，并可提高化疗药物的效果。在2015年全球十大畅销药物排行中，贝伐株单抗排名第6位，销售额达72.79亿美金。我国的抗体药物产业尚处起步阶段，虽然近10年间国内先后涌现出中信国健、百泰生物等多家专门从事单抗药物生产的企业，并且同时许多传统制药企业也加入到抗体药物领域中来，但总体而言，我国抗体行业普遍存在着细胞系表达水平低、培养规模小、纯化能力不够等技术问题，限制了我国抗体药物产业的产能规模，制约了行业的发展进程。贝伐珠单抗的未来还是很有市场前景。2.设计原理2.1血管生成与贝伐珠单抗的抗肿瘤作用机制肿瘤依赖周围组织的血管来获取血液供应，以不断地成长和扩散。研究发现，在直径超过100～200μm的肿瘤生长过程中，血管的形成发挥了至关重要的作用，而异常的血管生成过程，导致肿瘤组织的脉管系统呈现结构紊乱、血供差、血管通透性增加等特点，这些特点又致使恶性肿瘤对细胞毒性化疗药物的利用效能降低，并增加了转移的风险[2]。血管生成是一个极其复杂的过程，需要脉管系统、循环内皮细胞以及包括VEGF在内的促血管生成介质的参与。其中，VEGF/VEGFR是一条重要的信号传导途径，VEGF通过与组织上皮细胞中表达的VEGFR-l和VEGFR-2相结合，激活细胞内的信号传导途径，导致血管内皮细胞增殖及新生血管形成[3]（又见：Borgstr?m等,AnticancerRes,1999年）。VEGF的表达与恶性肿瘤的进展、期别、腹水形成、无瘤生存时间缩短及总体预后差有关[4]。免疫组化检查发现，VEGF在肿瘤及其转移组织中均有表达，且在恶性腹水和血清中可检测到。而在肿瘤患者体内所检测到的VEGF和VEGFR表达是独立的预后因素（Borgstr?m等,CancerRes,1996年）。更重要的是，VEGF的表达具有肿瘤特异性，其在恶性肿瘤中高表达，在交界性肿瘤中中等强度表达，而在正常组织中几乎不表达。此外，由VEGF介导的新生血管因基底膜存在间隙，使得肿瘤细胞易于扩散。因此，VEGF被认为在肿瘤生长、腹水形成和肿瘤转移中发挥着重要作用，针对血管形成的靶向治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。贝伐珠单抗作为一种重组人单克隆抗体，是目前被研究最多的抗血管生成药物，其作用机制是，通过与VEGF结合，从而阻止VEGF与其自然受体——VEGFR结合，抑制血管内皮细胞增殖和活化，从而发挥抗血管生成和抗肿瘤作用。此外，按照Jain提出的有悖于传统的设想（Jain,NatMed,2001年），抑制VEGF，将重启促血管生成和抗血管形成的平衡，导致扭曲异常的肿瘤组织结构、功能及其微环境和脉管系统趋于正常化，从而促进化疗药物的吸收，并减少肿瘤转移的机会[3-8]（又见：Borgstr?m等,CancerRes,2012年）。2.2贝伐珠单抗在肿瘤治疗中的应用2.2.1用于结直肠癌近年来，化疗联合抗血管生成治疗的应用，使转移性结直肠癌（mCRC）患者的死亡率显著降低。多项Ⅱ/Ⅲ期临床研究均显示，贝伐珠单抗联合化疗，可显著提高治疗效果。Hurwitz等[10]将813例进展期结直肠癌患者随机分成两组，采用5-氟尿嘧啶（5-FU）+亚叶酸钙+伊立替康联合或不联合贝伐珠单抗进行治疗，结果显示，化疗联合贝伐珠单抗组受试者的总生存期(overallsurvival，OS)较单纯化疗组明显延长（20.3个月vs15.6个月，HR=0.66，P0.001），而两组的无进展生存期(progression-freesurvival，PFS)分别为10.6个月和6.2个月，客观反应率(objectiveresponserate,ORR)分别为44.8％和34.8％，差异有统计学意义，说明联合贝伐珠单抗的化疗方案更加有效。贝伐珠单抗的出现与使用，在原化疗的基础上，可显著延长CRC患者的OS和PFS，且其联合伊立替康或奥沙利铂为基础的化疗，均能产生显著疗效；其在一线治疗失败后继续使用仍有机会获益，这在临床上为mCRC的治疗提供了新的跨线治疗模式。当然，在贝伐珠单抗的使用过程中，常见不良反应如高血压等也需密切观察和必要的干预。2.2.2用于多形性胶质母细胞瘤多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是恶性胶质瘤的一种，是高度血管化的肿瘤。VEGF在胶质瘤及其周围组织中均有表达，并且随着肿瘤恶性程度的增高而上调，但在正常脑组织中几乎不表达，且VEGF介导的新生血管生成与胶质瘤侵袭性、恶性程度及治疗失败等密切相关[18-19]。作为VEGF抑制剂，贝伐珠单抗被认为可以抑制GBM的进展。2.2.3用于新诊断的多形性胶质母细胞瘤贝伐珠单抗同样被证实可用于治疗新诊断的GBM患者。一项名为AVAglio的临床研究中，921例新诊断的GBM患者分成两组，分别接受放疗、替莫唑胺联合或不联合贝伐珠单抗治疗。结果显示，与不联合贝伐珠单抗组相比，联合贝伐珠单抗组受试者的PFS显著延长4.4个月（10.6个月vs6.2个月，P0.001）,进展或死亡风险降低36%，副作用与已知的贝伐珠单抗副作用一致。表明，贝伐珠单抗用于新诊断的GBM患者，同样具有较好的疗效和安全性[24-25]。GBM患者的标准疗法为手术切除及同步放化疗，但预后一直很不理想，复发几乎很难避免，5年总生存率不足10%，这一疾病的治疗一直是临床工作的难点[26-27]。贝伐珠单抗的出现，为这一疾病的治疗带来了新的治疗模式和希望。目前，贝伐珠单抗用于GBM的治疗，尚处起步阶段，世界范围内的应用还仅局限于复发性GBM患者，不过日本已批准贝伐珠单抗用于新诊断的GBM患者。此外，贝伐珠单抗用于GBM的远期疗效、联合用药及治疗时机等问题，仍有待进一步研究。3技术路线3.1贝伐株单抗的研究进展贝伐单抗是抗VEGF的人源化单抗,主要通过中和VEGF来阻断其与内皮细胞上的受体结合,使得肿瘤细胞不能得到养分和氧,起到治疗肿瘤的作用。Presta等将鼠抗人VEGF单克隆抗体(muMABVEGF)A.4.6.1的互补决定区与人IgG1的恒定区框架嵌合,并对相应氨基酸残基加以修饰,最终形成了人鼠嵌合型VEGF单抗,仍然有7%的氨基酸来源于鼠抗体。实验表明,贝伐单抗用于治疗肿瘤安全有效。贝伐株单抗是10年前批准的治疗结肠癌药物，2004年由FDA批准，2005年获得欧盟批准，在美国的专利有效期为2019年，在欧盟的专利有效期为2022年。2010年获得中国CFDA批准，并于2015年获得肺癌适应症的批准，用于晚期、转移性或复发性非鳞非小细胞肺癌的一线治疗。截至目前，俄罗斯的Biocad公司、美国的Pfizer公司正在进行III期临床实验，德国的BoehringerIngelheim公司已于7月份启动III期临床，目前正在招募临床实验志愿者。贝伐株单抗也是一种比较特别的药物，医生们不断地发现了他的新疗效，这也为罗氏赢得了更多的许可和盈利。2012年FDA批准贝伐株单抗为治疗转移性结肠癌的第二线药物，日本批准其为治疗脑癌的第一线药物，贝伐株单抗现在还在进行6种治疗方向的临床实验。3.2制备思想采用重组DNA技术，人工合成贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因，将此克隆的重链与轻链基因片段分别插入到自行构建的一种高效逆转录病毒前载体，将获得重链表达前载体和轻链表达前载体分别与病毒包装质粒pHCMV-G共转染包装细胞293GP，制备获得两种分别携带有贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因的逆转录病毒载体。两种逆转录病毒载体先后交替转导CHO-S细胞，获得可稳定表达贝伐株单克隆抗体的工程细胞。应用先进的细胞培养技术，经过细胞的扩增培养和发酵表达培养，在哺乳动物细胞表达系统中国仓鼠卵巢细胞中产生贝伐珠单抗，然后采用包括病毒灭活和去除步骤在内的纯化工艺进行纯化，再经过配制、除菌过滤、无菌灌装等制剂生产工艺获得成品。通过多次实验对细胞培养工艺、纯化工艺及制剂生产工艺的各个工艺参数进行不断的摸索和优化，最终确定了高效表达贝伐株单克隆抗体的生产工艺。3.3制备方法3.3.1工程细胞的构建和鉴定人工合成贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因，DNA测序分析表明其编码的氨基酸序列与同类上市产品AVASTIN?（安维汀?，贝伐株单抗注射液，罗氏公司）公开的氨基酸序列完全一致。将此克隆的重链与轻链基因片段分别插入到自行构建的一种高效逆转录病毒前载体pCS-newMCS-WPRE（newori），分别获得重链表达前载体pCS-HideawayHC-WPRE（newori）和轻链表达前载体pCS-HideawayLC-WPRE（newori）。将pCS-HideawayHC-WPRE（newori）和pCS-HideawayLC-WPRE（newori）分别与病毒包装质粒pHCMV-G共转染包装细胞293GP，制备获得两种分别携带有贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因的逆转录病毒载体。两种逆转录病毒载体先后交替转导CHO-S细胞，获得可稳定表达贝伐株单克隆抗体的工程细GCHO-S/sC-Hideaway-LC2/HC3-R，肽图、等电聚焦和生物学活性检测均证实该细胞株。分泌表达的贝伐株单克隆抗体与AVASTIN?具有结构上的高度一致。有限稀释法挑选单克隆，经多轮筛选得到一株可高水平分泌表达该蛋白的细胞株GCHO-S/sC-Hideaway-LC2/HC3-RB008，在细胞培养瓶中的表达量达1.0mg/ml。实时荧光定量PCR对连续传代30代的细胞进行目的基因拷贝数分析，结果显示经长期传代，各代次细胞中拷贝数水平稳定（重链基因5.6±0.7拷贝/细胞，轻链基因20.3±8.2拷贝/细胞）；基因测序分析结果显示各代次细胞中目的基因序列完全一致，表明目的基因稳定整合在CHO细胞染色体中。以上工作证实了所建立的GCHO-S/sC-Hideaway-LC2/HC3-RB008工程细胞株可稳定高水平表达贝伐株单抗，该抗体具有与AVASTIN○R相似的生物学特性。以GCHO-S/sC-Hideaway-LC2/HC3-