第09章基因工程和基因组学

第九章基因工程和基因组学1971年，Smith等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年，Berg等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子。1973年，美国斯坦福大学医学院的Cohen教授及其同事把抗四环素基因插入大肠杆菌质粒DNA后，组成一个重组DNA，结果发现这一个重组DNA能在大肠杆菌中复制,并具有抗四环素遗传表型。StanleyN.Cohen1974年,Cohen教授和加州大学的Boyer教授，将非洲蟾蜍的rRNA结构基因插入大肠杆菌质粒DNA，再转化入大肠杆菌，结果发现非洲蟾蜍的rRNA结构基因得到表达。上述实验说明，经DNA重组后的外源基因可在宿主体内成功表达。HerbertW.Boyer1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1985年，转基因植物获得成功。1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1996年，克隆羊诞生。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的2550万亩发展到2009年的20亿亩，14年间增长了79倍。199619971998199920002001200220062007200820090.0170.110.2780.3990.4421.331.251.110.50.52600.20.40.60.811.21.4年份亿公顷广义遗传工程包括:生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义遗传工程是指:基因工程(重组DNA技术)。一、基因工程概述:第一节基因工程１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式,按照预先设计的蓝图，借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向获得新遗传性状的一门技术。基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。切接转增检2．基因工程操作过程：3．内容：①从细胞和组织中分离DNA；②限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段；③将酶切DNA分子与载体DNA连接构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子；④把重组DNA分子引入宿主受体细胞复制；⑤重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞建立无性繁殖系(Clone)或发育成个体；⑥从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子；⑦使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质并分离、鉴定基因产物。目的基因载体转化与鉴定内切酶重组DNA表达一般而言，一个基因是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。二、基因的分离与鉴定利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。㈠从基因库中分离基因：1.构建基因库（library）基因库是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。①核基因库：核基因库(genomiclibrary)：将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。构建文库可采用不同的载体：质粒载体：重组质粒导入感受态细胞，收集所有菌落。噬菌体或(柯斯质粒)载体：重组DNA包装进噬菌体，感染细菌，收集噬菌斑。BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体：重组人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基因库。②染色体基因库：将基因组的一部分如一条染色体用来构建基因库可选择特异基因以及分析染色体结构和组织。果蝇的多线染色体中，对染色体进行微切割，构建染色体区段基因文库。如对X染色体上多线染色体带的分析。人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离(flowcytometry)技术将人类染色体分开，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。流式细胞分离原理酵母菌：利用改良的脉冲电泳方法(pulsedfieldgelelectro–phoresis,PFGE)，将酵母菌16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。③cDNA库：以mRNA为模板经反转录酶合成互补DNA构建基因库。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列,利用一段多聚T为引物与多聚A互补配对，在反转录酶的作用下，即可获得cDNA第一链。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列得到的双链DNA分子经两端补齐后以带有限制性酶切点的人工接头连接酶切后与载体(通常是噬菌体)连接制备cDNA库。mRNA1.cDNA第一链的合成5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs2.cDNA第二链的合成煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp5’DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’S15’AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp3’TTTTTTTTTTTTTTOH5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5GGAAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5GGAAAAAOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPscDNA库与核DNA库不同：cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列仅包括基因组的部分基因序列。cDNA库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。2.筛选基因库：根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件从基因库中筛选、分离基因；常用的基因库筛选方法有表型筛选法、杂交筛选法、混合池PCR筛选法、差减杂交法、图位克隆法、酵母双杂交法等；多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针筛选基因库。密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆文库筛选流程筛库过程：将转化或转染后菌落印影在滤膜上用碱裂解、中和后洗涤烘干再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探针进行杂交放射性自显影凡黑点菌落即为阳性克隆。影印洗涤杂交感光①.限制性酶图谱：构建阳性克隆的限制性酶图谱根据同源性分析，可了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。(二)阳性克隆的分析与鉴定：从基因库中筛选出的阳性克隆分析、鉴定得到目的基因。限制性酶图谱构建方法(15kb)将阳性克隆DNA分装3个管中酶切DNA琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色紫外灯下见到DNA带。从凝胶电泳结果分析：模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。用类似的方法，将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。②.核酸分子杂交：Southern杂交分析：由英国的Southern发明(1975)，一种将琼脂糖中的DNA转移到尼龙膜进行DNA分子杂交分析的方法。筛选基因库得到阳性克隆后将限制性酶酶切与Southern杂交结合绘制限制性酶图谱。Northern杂交分析：用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在。原理和程序与Sorthern杂交相同。Western杂交分析：用于蛋白质的分析。③.核酸序列测定克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后确定该DNA片段序列的正确性。一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法测定核酸序列。CGCTCAGCTGGTGATTGTGT55333-5磷酸二酯键在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：④.核酸序列分析：测定的核酸序列为何基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一步分析。（1）同源性比较将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同源性，将序列发送到Genbank等DNAData数据库进行比较。EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,网址：Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,网址：Swissport/TREMBL网址：对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有翻译起始信号和终止信号等。（2）分析核酸序列的阅读框架GmMYBZ2ORF：744bp247aaMYB-DNAbinding1:13-63aaMYB-DNAbinding2:65-114aa具有转录抑制作用的保守基序：pdLNLD/ELXiG/SGmMYBZ2空间结构预测（CHPmodels-2.0服务器）GmMYBZ2蛋白的三维空间结构预测红色：a-螺旋；蓝色：b-折叠；白色：无规卷曲（三）PCR扩增基因：聚合酶链式反应(polymerasechainReaction,PCR)可以体外快速扩增DNA。美国Mullis(1986)发明，是现代生物学发展史上的一个里程碑。PCR技术是以DNA互补链的聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交，由DNA聚合酶催化引物延伸，最终获得特异DNA片段的体外扩增方法。DNA模板变性退火延伸循环1变性退火延伸循环2RF1324变性退火延伸循环31234基本要素模板：待拷贝的DNA,可以是双链,也可是单链DNA；引物：引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物；DNA聚合酶：DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。dNTP：DNA合成的底物。使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。（四）人工合成基因：根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来可很快地人工合成基因。如SOE-PCR(splicingbyusingoverlappedextension)技术可扩增出完整的基因序列。1.化学合成的寡聚核苷酸(80-100个核苷酸)通过SOE将单链部分补齐；2.PCR