质粒DNA的提取实验一

实验一质粒DNA的制备一、实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。二、实验原理碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、实验材料:大肠杆菌DH5ɑpETHIS四、仪器与主要试剂(一)仪器设备1．恒温培养箱2．恒温摇床3．台式离心机4．高压灭菌锅(二)器材1．1.5mL离心管2．枪头、枪三)试剂溶液I：50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶液II：200mmol/LNaOH、1%SDS（新鲜配制：0.8mlddH2O,0.1ml2mol/LNaOH,混匀，0.1ml10%SDS混匀）溶液III：3mol/LNaAc(pH4.8)溶液TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl,pH7.5、1mmol/LEDTA五、实验步骤1.取DH5ɑpETHIS大肠杆菌菌液于LB（含Amp）平板上37℃过夜培养；2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250r/min过夜培养；3.吸取1.5ml菌液，12000g离心5分钟，去上清（尽量将上清倒干净），收集菌体；4加入100μl溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；（剧烈）5.加入200μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；6.加入150μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；（温和）7.12000g离心10分钟；取上清液400μl（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中8.加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20度2小时（或2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟）；9.12000g常温离心15分钟；10倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；11.室温放置或超净台上风干DNA；12.加20μl灭菌超纯水或TE溶解；13.质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。如需获得纯度较高的质粒DNA，在第7步：（1）加等体积苯酚,氯仿与异戌醇（25:24:1）抽提一次或两次，每次抽提后离心，取上相（即水相）（2）加1/10体积的NaAC，混匀；下面接第8步。