质粒DNA的转化实验原理仪器试剂和操作步骤

质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤【原理】转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R-，M-）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA分子的细胞）。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。【试剂与器材】1．LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。2．LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。3．0.1mol/LCaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。4．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。5．人Bcl-2重组质粒它是EcoRⅠ单酶切的pBluescriptⅡKS(-)载体与EcoRⅠ单酶切的人Bcl-2cDNA重组而成的，大小为4861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2961bp的质粒载体。因此用EcoRⅠ酶切则应到空载pBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μl。6．大肠杆菌DH5α此为DNA扩增菌7．恒温水浴箱8．超净工作台9．高速冷冻离心机10．恒温摇床11．恒温箱12．消毒离心管13．消毒tips14．玻璃培养皿直径90mm15．玻璃涂布器16．95%乙醇17．标记笔【操作步骤】1．细菌感受态细胞的制备将DH5α菌种划线于LB琼脂板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于5mlLB培养基中，37℃振荡培养培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基的烧瓶中，37℃剧烈振荡培养至约2～3h，待A600值达到0.3～0.4时将烧瓶置于冰浴10～15min。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml离心管中。4000×g，4℃离心10min，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，置冰浴30min。4000×g，4℃离心10min，弃培养基。再加4ml预冷的0.1mol/LCaCl2，轻轻重悬菌体，置4℃冰箱12～16h。2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α本实验中的DNA重组子为人Bcl-2重组质粒。在无菌条件下按每管取200μl新鲜感受态DH5α细菌置于无菌的5ml塑料离心管中，共2管，分别加入人Bcl-2重组质粒(10ng)和消毒水(作阴性对照)各5μl，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。42℃，热休克90s，中途不要摇动离心管，每管加800μl无抗生素的LB培养基，于37℃空气摇床中以150r/min速度振摇45min，使细菌复苏。每管取200μl加至含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置20min，使液体吸收，然后37℃倒置培养12～16h至单菌落形成。【注意事项】1．含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌落平板倒置置于4℃保存，于下周进行质粒DNA的制备。