质谱法离子源和分析器.

质谱法电离源和质量分析器4.1.3.1电子轰击电离(ElectronImpact,EI)1、组成部分灯丝：钨、铼或铼钨丝，发射电子，电离样品收集极：接收灯丝发射的电子推斥极：推出产生的样品离子永久磁铁：使电子做螺旋运动，增加电离几率2、电离效率曲线灯丝产生的电子被加速到70eV,保证电离的重现性。为什么？电离效率随电子能量的升高而升高，当达50eV时，基本达到最大值，实验上设定电子能量为70eV。此时，产生的谱图有稳定的指纹特征。电离效率曲线电子能量对质谱图的影响204060801001201400204060801007710512220eVRelativeAbundancem/z204060801001201400204060801001229eVRelativeAbundancem/z2040608010012014002040608010039517710512270eVRelativeAbundancem/z不同能量下获得的苯甲酸的质谱图4.1.3.2化学电离(ChemicalIonization,CI)利用反应气体的离子与样品分子相互反应，而使样品分子离子化，本质是化学过程，故称化学电离。离子出品的缝隙减小，使高子室内的压力保持在0.5-1.0Torr。电子轰击化学电离气体，不直接作用于样品分子。推斥电极电压：0V，增加源内停留时间，有利于离子-分子反应。化学电离试剂：甲烷、异丁烷、氨气，氢气，水、甲醇、胺等。以甲烷为例，化学电离源内的有关离子-分子反应，CH4+eCH4++CH3++CH2++CH++C++H2++H+CH4++CH4CH5++CH3CH3++CH4C2H5++H2CH5++XHXH2++CH4C2H5++XHXH2++C2H4C2H5++XHX++C2H6化学电离离子-分子反应常见类型质子转移反应BH++MMH++B氢负离子转移反应BH++M[M-H]++BH2电荷交换反应B++MB+M+加成反应BH++M[BHM]+或[BMH]+4.1.3.3二次离子质谱(SecondIonMassSpectrometry,SIMS)快原子轰击(FastAtomBombardment,FAB),Ar原子快离子轰击(FastIonBombardment,FIB)Cs离子FAB：Ar与被加速到~20kV的Ar+进行弹性碰撞，使Ar获得相应的动能，射向样品靶，产生轰击作用。FIB：Cs+由CsI加热后放出来，然后通过电场加速到~20kV，射向样品靶，产生轰击作用。适用于极性分子的分析，生物分子，质量在2000以内。基质的作用：一般为强极性分子，对快原子或快离子有较强的吸收能力，可使进样品溶液溶解，溶剂挥发后，基质结晶，样品均匀分布于该结晶体中，轰击时一起蒸发。基质分子量沸点ºC背景离子应用甘油92182/20mmMH+,[MH+nM]+普通基质硫甘油108118/5mm[M-H2O]+,[MH+nM]+肽、抗生素间硝基苄醇153175/3mmMH+,[MH+nM]+肽、蛋白质二乙醇胺105217/150mmMH+,[MH+nM]+多糖三乙醇胺149190/5mmMH+,[MH+nM]+多糖硫代二甘醇94-[M-H2O]+,[MH+nM]+金属有机物二硫苏糖醇二硫赤糖醇(5:1)120-[M-H2S-H2]+,[MH+nM]+金属有机物,肽四亚甲基砜120285MH+,[2M+H]+肽聚乙二醇62+n(44)-(CH2CH2O)H+,MH+多糖FAB/FIB常用基质4.1.3.4基质辅助激光解吸电离(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization,MALDI)试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。基质吸收大部分激光能量，减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。激光：固体氮激光，紫外光波长：337nm功率：106~108W/cm2脉冲时间：10-6~10-9秒关于基质：极性化合物溶解样品芳环吸收激光易结晶均匀分散样品分子MALDI常用基质基质性状适用波长应用烟酸固体266nm,2.94m,10.6m蛋白质2,5-二羟基苯甲酸固体266nm,2.94m,10.6m蛋白质芥子酸固体266nm,337nm,355nm,2.94m蛋白质-氰基-4-羟基肉桂酸固体337nm,355nm蛋白质3-羟基吡啶甲酸固体337nm,355nm核酸、配糖体2-(4-羟基苯偶氮)苯甲酸固体266nm,337nm蛋白质、配糖体琥珀酸固体2.94m,10.6m蛋白质、核酸间硝基苄醇液体266nm蛋白质甘油液体2.94m,10.6m蛋白质邻硝苯基辛基醚液体266nm,337nm,355nm合成高分子蛋白质组分析。MALDI的特点：优点：质量范围可达50万Da。高灵敏度，可测至10-12~10-15摩尔。软电离，没有或很少有碎片离子，可用于分析混合物。可容纳毫摩尔级的盐。缺点：基质背景易干扰质量数1000Da以内的物质分析。激光解析电离可能导致被分析物分解。4.1.3.5电喷雾电离(Electro-SprayIonization,ESI)毛细管直径0.1~0.2mm。喷雾电压：毛细管尖端与离子引入口之间，3~8kV。壳气(Sheathgas),从毛细管端与喷雾反向加热后流出。离子通过取样锥(Skimmer)和毛细管(Capillary)传送至光学聚焦系统。电喷雾电离的基本过程电场下的喷雾带电雾滴壳气的作用下溶剂的蒸发电荷的库仑作用带电雾滴的解体Rayleigh极限表面张力和库仑斥力的平衡点ReproducedfromKebarle,P.J.MassSpectrom.2000,35,804-817.电喷雾电离产生多电荷离子：可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将质谱仪的质量范围放大的n倍。例肌红蛋白电喷雾质谱图带10~30个电荷的系列分子离子4.1.3.6大气压化学电离(AtmospherePressureChemicalIonization,APCI)毛细管样品送入加热管中，该管可以达到300ºC以上。在加热管中溶剂挥发。加热管出口处放置电晕(Corona)放电装置,使挥发出来的溶剂分子电离，形成等离子体。等离子体与样品分子反应，生成[M＋H]+或[M－H]–准分子离子。APCI特点软的电离方式，样品直接从液从中拉出来的，不是蒸发，基本不产生分解，电离过程属于离子-分子反应，与CI原理相似。快速地适合高低含量水溶液的流动相，可作梯度分析。单电荷峰，实现源内CID。MolecularWeightNon-PolarPolarEI/CIElectrosprayAPCI100,0001000WhichIonisationMode?仪器的加速电压V：使离子具有高的动能，快速通过磁场、电场和无场区。某一离子：质量为m，电荷价态为z，从加速电场获取的电能为zeV。该离子的动能为1/2mv2v为离子的运动速度，两个能量是相等的。即：4.1.4质量分析器种类繁多，磁场、电场、射频场对电荷离子的控制作用。4.1.4.1扇形磁场和静电场(SectorAnalyzer)离子在扇形磁场中的运动zeVmv2211、离子在扇形磁场中的运动e2rrmvzeE将离子动能mv2/2=zeV代入上式，则得：re2EVr半径为re圆弧上，电场强度为：其中E为静电场的电压。若Er固定，则离子运动半径随加速电压的改变而改变，因此静电场是能量分析器。离子在扇形电场中的运动2、离子在扇形电场中的运动Er为离子运动轨道上的电场强度re为离子在电场中作圆周运动的半径，即电场的半径。21er/ln21rrErE代入re=2V/Er中得：E=Vlnr1/r2,r1和r2是固定的。所以，在双聚焦质谱仪中，静电场电压与加速电压维持着一定的比例关系。2、双聚焦质谱仪基本原理扇形磁场质量色散，分析离子原因，实际上是动量分析器。方向聚焦，相同质量和相同速度的离子，从同一点以不同角度入射到磁场中，在磁场中所走轨迹不同，但在磁场后可集中于某一点，与方向无关。静电分析器能量分析器方向聚集，同磁场。离子源中引出的离子：运动方向不平行。（角色散）存在能量色散，初始的温度分布和电子轰击时所产生的附加动能。双聚集ESA使由离子源发散出来的离子束按动能聚焦成一系列的点，再经磁场将具有相同质核比分开的离子束再聚焦到一点。两组四极杆分别加上+(u+Vcost)和–(u+Vcost)，其中u直流电压部分，Vcost为射频电压部分=2f,f为频率。理想的四极场为双曲线型，但加工的困难，用四根杆代替。在四极场中任一点的电场为：4.1.4.2四极杆质量分析器(QuadrupoleMassAnalyser)2022)cos()(ryxtVuxyt在场的中心和两条对角线上的任何一点电位为零。离子在射入四极场后，其运动方程ma=eEa为离子加速度，E电场强度电场强度为电位的导数。则上式在直角坐标系展开为：在四极场中任一点的电场为：zφedtzdmyφedtydmxφedtxdm222222代入上式得：0cos2cos22220222022dtzdmyrωt)Ve(udtydmxrωt)Ve(udtxdm令：248220220tmreVqmreua合并上几式得：02cos202cos22222yε)q(adεxdmxε)q(adεxdmMathieu方程Mathieu方程解，复杂，与边界条件密切相关。以a,q为坐标，方程的解作图，三个区：稳定区，x不稳定区，y不稳定区。a,q都是交直流电压幅值、频率和时间的函数，可由仪器设定和调节，r0是仪器中心到四极杆的径向距离，其值是确定的。扫描线：与稳定区相截并且通过原点的直线。在这条直线上，各处的a/q比值都为常数，即u/V=a/q亦为常数。同质荷比的离子对应有不同的a,q值，对于具有使u/V=a/q为常数的离子来说，其a和q值均在扫描线上。如果其值恰好处于扫描线和稳定区的两个边界交点(A，A)之间，则该离子落在稳定区之内。改变u/V的比值，扫描线斜率变化，增加，AA长度减小，即能够稳定的离子减小，分辨率增加。AA长度仅与u/V比值有关。固定u/V比值(即保持AA长度不变，也就是分辨率不变)，改变V的幅值，可使不同质荷比的离子先后进入稳定区，顺序通过四极杆之后被接收，得到一组不同质荷比的质谱。稳定区:离子产生稳定的振荡，沿z方向通过四极杆。不稳定区:离子振幅不断增大，最后飞出四极场或与z和y电极碰撞中和。离子阱质谱由四极杆质谱仪发展而来。四极杆变为环极，四极杆两端加端帽。端帽和环极上均加有直流电压U，射频电压(振幅为V，角频率)。离子的运动仍由Mathieu方程描述。较理想的离子阱质量分析器：r02=2z024.1.4.3离子阱质量分析器(IonTrapMassAnalyser,IT)Mathieu方程的解：蓝色区为稳定区，其它为不稳定区，空间分布，这里仅是一个截面。捕集时(Trapping)，设定U,V和，使各种离子在蓝色区域的最式边。扫描时(Scanning)，给定U,V和，使扫描线按qz=0的由左到右进行，离子从小质荷比到大的质荷比依次排出到检测器。离子阱中引入~10-3Torr氦气，使离子运动受到阻尼，提高离子轨迹的稳定性，进而提高仪器的分辨率和灵敏度。4.1.4.4飞行时间质量分析器(TimeOfFlightMassAnalyser,TOF)离子源中的离子经加速电压获得的速度为：其中ze为电荷，V为加速电压，m为质量。mzeVv2飞行管长度L，到达检测器的时间为：质量越大，飞行时间越长，实现分离。zeVmLvLt2m1和m2两个离子：zeVmmLt2)(21用已知样品进行校正，得到未知离子的质量。ttmm2仪器的分辨率近似