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第七章抗原抗体反应及应用不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫应答，产生相应的抗体。大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体)，又有反应原性(与特异的抗体相结合)。抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以在体外进行。一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。抗体反应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为—类微量，灵敏，快速的检测分析方法。本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。第一节抗体的制备环境中的大部分生物(包括病原生物)及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清(antiserum)，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体，所以称多克隆抗体(polyclonalantibody)。一个B细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。用免疫动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合，在体外可以分离出许多单个B细胞克隆，以此方法可制备单克隆抗体(monoclonalantibody)。随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库(antibodycombinatoriallibrary)筛选制备单克隆抗体。应用基因工程技术，根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体(engineeringantibody)，以及催化性抗体(catalyticantibody或abozyme)等的全新的抗体。一、抗血清的制备1．免疫动物(1)抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接，连接剂见表7—1。抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg／次至几mg／次。〔2)佐剂及乳化：佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。佐剂有完全和不完全佐剂之分。完全佐剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗)或棒状杆菌。福氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按1：2—4混合自行制备。佐剂与抗原按1：1的比例混合乳化为均匀的乳液，放置后不会发生油水分离。(3)免疫动物：常用于制备抗血清的动物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生产可用动物羊、马等，动物接受免疫的乳液量小鼠为1．0—2．0mL，家兔为2—4mL。抗原免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和是否使用佐剂。腹腔注射(i．p)，肌肉注射(i．m)，皮内注射(i．d．)和皮下注射(s．c．)适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免疫应答，初次免疫和免疫加强注射均可使用。静脉注射(i.v.)则只适合于可溶性抗原及分散的单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。此外，在单克隆抗体制备时，亦可用脾脏直接注射或体外免疫方法，尤其对微量抗原比较实用。体外免疫方法也常用于人源单克隆抗体的制备。体外免疫时将脾细胞或外周血淋巴细胞(包括B细胞，T细胞及抗原递呈细胞)与抗原一起作体外培养，然后再与骨髓瘤细胞融合。初次免疫后要经过2—3次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的IgC抗体。两次免疫注射之间的时间间隔，一般3—4周比较适合大部分动物，小动物可间隔10—14d，大动物则在2月左右。在免疫加强最后一次注射后的一周内采集抗血清，可获得高水平的抗体。2抗血清的纯化与保存（1）采血：加强免疫的动物2—3次后，可通过耳静脉或眼球(小鼠)采血，进行抗血清效价测定。当效价达到理想的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血，也可通过动脉放血。待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。(2)抗血清的纯化与保存：除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。为了避免这些蛋白质干扰抗体(免疫球蛋白)标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的机体(常为IgG)组分。常用的纯化IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度的溶液中，其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水—盐结合比水—蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低。免疫球蛋白(Mr1.5×105)比血清中主要蛋白质白蛋白(Mr6.7×104)的分子大得多，抗体在30％—50％饱和度的硫酸盐中析出，而白蛋白需在70％—80％饱和度才析出，因此常用33％饱和度的硫酸胺纯化血清中的IgG。盐析时为了减少抗体变性，需在4℃进行，同时用pH8.0缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。铵盐的溶解度不随温度变化而明显改变，0℃和25℃仅差3％，而钠盐则相差5倍，因此常在低温沉淀时用铵盐，室温沉淀用钠盐。铵盐对抗体的标记反应(如FITC和biotin标记时)有一定的干扰作用。盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。IgM五聚体相对分子质量达9.7×105，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。IgG在PH8．0时带负电荷，能与DEAE纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化IgG。IgG纯化最常用的方法为亲和层析。IgG与葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白具合高度的亲和性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将IgG纯化。大部分IgG与蛋白A结合PH为8—9，洗脱PH为2—4；而与蛋白G的结合PH为5—7，洗脱PH为9—10。C蛋白更适合于IgG的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与IgG的结合力高于A蛋白。G蛋自能与大部分动物种类的IgG结合，而A蛋白对小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、马和绵羊IgG结合力弱或不能结合G蛋白和A蛋白均不能与鸡IgG结合。抗血清或纯化的抗体在低温保存可维持活性数年，反复冻融使抗体很快失活，被细菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀释的抗血清加入防腐剂叠氮化钠和保护剂如BSA等可于4℃保存。长期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于50％饱和硫酸铵中4℃保存，还可以冷冻干燥保存。3抗血清的特性鉴定根据不同目的制备的抗血清，对其中所含抗体的浓度，特异性及免疫球蛋白种类的要求也不一样。为了获得质量和数量上合符要求的抗血清，在收集动物血清前必须对免疫效果进行检测，对收获后的抗血清也必须对—些参数进行分析，如效价、亲和力及交叉反应等。根据不同的抗原性质选用合适的检测方法。最常用的为免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。效价又称滴度(titer)，是常用于表达抗血清中特异性抗体相对含量的—个半定量指标，即在给定的条件下，结合—定量抗原的抗血清的稀释度。抗血清经一系列稀释后(如倍比稀释)与定量的抗原反应，以能检测抗血清最大稀释倍数即为该抗血清的效价。不同的检测方法测定同一种抗血清的效价，灵敏度不一样，抗血清的效价也不一样，如沉淀反应(琼脂双扩散)与ELISA二者的效价相差甚大，后者远高于前者。放射免疫分析(RIA)常用于标记小分子抗原来检测抗血清的效价。亲和力(affinity)表示抗血清与相应抗原的结合强度，是描述抗体持异性的重要指标，常用亲和常数K表示。亲和常数K与抗原抗体反应的平衡常数有关：K+Ag＋AbAgAbK－[AgAb]K+K=K=[Ag][Ab]K－式中K+为结合速度常数，K－为解离速度常数。亲和常数K的测定见第二节抗体特异性与交叉反应：抗体是特异的。只与相应抗原反应。实际制备的抗体却常有非特异性反应，这是因为抗原不纯造成的。多组分抗原之间存在共同的抗原决定簇，或者两个抗原决定簇结构类似能与同一抗体结合，均可出现抗体与异源抗原的交叉反应。用琼脂双扩散能简便直观地反映不同抗原与同一抗血清，或不同抗血清与同一抗原的交叉反应。二、单克隆抗体的制备1制备原理单克隆抗体(MAb)与抗血清(又称多克隆抗体，PAb)最主要的区别是MAb为单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B细胞克隆的标志，是一种独特型的抗体，它的特异性是针对一个抗原决定簇的。制备单克隆抗体不能用化学分离的方法从多克隆抗体中去分离纯化得到它，而是用分离产生抗体的B细胞克隆的方法得到它。为了使B细胞克隆能在体外人工培养下长期存活并产生完全均一的MAb，G．KÖhler合Milstein于1975年创立了杂交瘤方法。所以制备单克隆抗体的技术又称杂交瘤技术(hybredomatechnique)。杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产（图7－1）。2．B细胞与瘤细胞的来源及杂交瘤选择原理最常用的单克隆抗体是小鼠的单抗，此外也有大鼠的和人源的单抗。人源单抗制备比较复杂。小鼠单抗的制备通常是使用Balb／c小鼠的B细胞和它的骨髓瘤细胞。大鼠的单抗制备通常用Lou／c大鼠及其骨髓瘤和Y3／AO大鼠及其骨髓瘤细胞(表7—2)。B细胞是从免疫动物的脾脏中分离出来的。动物免疫方法与抗血清制备相同，只是在制备脾脏前3d必须进行一次静脉加强注射以保证得到的B细胞有旺盛的分泌抗体的活性。骨髓瘤细胞有许多细胞株是经过诱变和筛选得到的缺陷型。筛选的标准是①瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的某种链，但不能分泌；②是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型。因为这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋吟(aminopterin)阻断后，由于缺失这些酶，即使补充它的底物次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)，核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，结果导致瘤细胞死亡(图7—2)。而杂交瘤细胞因带有B细胞的全套基因，在HAT存在的条件下借助于HGPRT和TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成DNA和RNA。所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。未被融合的游离的B细胞只能存活3d而后自行死亡。这就是用HAT培养基进行选择的原理。3．细胞杂交与选择培养(1)融合：细胞杂交之前，要分别准备好脾脏的B细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞(如SP2／0—Agl4细胞株)。免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎，将B细胞悬浮在没有血清的培养液中(通常使用RPMIl640商品配制)，并洗涤3次去掉小鼠的血清。SP2／0细胞是用加有10％胎牛或小牛血清培养的，每天更换新鲜培养液使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。细胞用RPMIl640洗涤2—3次，把两种细胞合并在同—试管中，用50％的聚乙二醇(相对分子质量为1000—1500)作为融合剂，在37℃条件下融合l—2min。然后用1640培养液缓慢稀释，然后除去PEG，将细胞分散至HAT选择培养板中。电融合方法也可用于单克隆抗体制备，虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故限制了其广泛使用。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例在5：1—10：1均可获得满意结果，每次融合细胞数量在107—108较为合适。融合后的细胞在40或96孔板上的HAT培养液(RPMIl640含10％—20％胎牛或小牛血清和HAT)中37℃，5％CO2条件下培养。融合后的细胞悬液中只有脾细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中生长，其他形式的融合细胞均不能生长．未融合的细胞也不能在HAT培养液中生存(表7—3)。在融合后的细胞培养过程中，饲养细胞(feedercell)有助于杂交瘤细胞的生长。饲养细胞可用同种动物的腹腔细胞或胸腹细胞。腹腔细胞中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片。使背景更为清洁“干净”。同时饲养细胞分泌的细胞因子或活性物质有助于杂交瘤细胞的生长。现有商品“杂交瘤细胞生长因子”可用于替代饲养细胞。(2)阳性杂交瘤细胞的筛选与单克降化：杂交细胞经约10—14d培养后，形成可用的细胞集落(克隆)。经过几次更换培养液(HT培养