第七节抗体分子的改造和基因工程

第七节抗体分子的改造和基因工程自1975年Catton和Milstein等研究制造出单克隆抗体（MAb）技术以来，获得了迅速的发展和极为广泛的应用。但也确实存在不少难以克服的问题，如绝大多数的Mab是鼠源性的，对人有较强的免疫原性。如果用于人的治疗，不出2周就会产生人对鼠血清的免疫应答，患者体内存在的人抗鼠抗体（humananti-mouseantibody,HAMA），不仅降低了疗效，严重的可引起患者出现血清病。随着分子遗传学、生物化学、特别是分子生物学的发展，人们开始着手利用DNA分子重组技术，改造和生产所需要的特异性单链抗体、免疫粘连素、超变区多肽，直到用丝状噬菌体表面呈现技术构建和筛选抗体基因文库。一、双特异性抗体免疫球蛋白分子具有重链、轻链组成的4条肽链结构，它们共同组成2个抗原结合点。由于2个结合点的抗原特异性相同，故表现为单一特异性。双特异性抗体是将2个结合点表现为不同的特异性，抗体的一个结合点的特异性表现为靶细胞（如肿瘤细胞）结合，另一结合点可与药物（如蓖麻毒素、抗癌药物、细胞毒性细胞）结合。这种双特异性的结合，可使作用物直接地、高密度地作用于靶细胞，提高了疗效，从而可相对地减少对患者的副作用。制备双特异性抗体的方法主要有3种方法：（1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式：重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子：LH-HL，KG-GK重链特异性相同的配对抗体分子：LH-HK，KH-HKKG-GL，LG-GL重链、轻链特异性不同的配对抗体分子：LH-GK，LH-GLKH-GL，KH-GK在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才是所需的双功能抗体分子。（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早从事这方面的研究。化学交联的方法无需经过细胞融合，所以比较简便易行。通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一起。用于制备双功能抗体的Mab可以是完整分子，也可是经胃酶水解获得F（abˊ）2片段。后者在减少鼠源免疫原性方面，效果较好。（3）利用基因工程技术将两套重轻链基因导入骨髓瘤细胞或传染瘤细胞中。这种方法制备的双功能抗体可选择合适的稳定区和合适的类及亚类，而得到较好的产量较高的双功能抗体。由于只有较少的嵌合导入并整合到宿主基因组，故传染瘤细胞更为稳定，染色体不易丢失二、嵌合抗体在肿瘤治疗中，带有抗瘤药物或同位素等的抗体具有导向作用，从而可定位诊断或定向杀伤肿瘤细胞。为解决鼠源免疫Mab免疫原性这一难题，人们又设计了小鼠-人工嵌合抗体（chimerieantibody）的新型抗体。其原理是取某一Mab基因的V区，与人Ig基因的C区连接，然后插入到表达质粒中，传染骨髓瘤细胞即产生出鼠-人嵌合抗体。由于Ig的C区是人源的，这种抗体对人的免疫性就大为降低，采用不亚类的人C区基因，便可改变抗体的效应功能，以获抗肿瘤的最佳效果。鼠-人嵌合抗体并不能彻底清除鼠源免疫原性，于是进一步提出重构抗体的设想。即：人化抗体三、人化抗体抗体的抗原结合区域（V）与空间结构主要由抗体V区中3个CDRS（互补决定区）所决定，所以这一抗体的构建是用原鼠IgV区中的CDR区插入到人IgV的框架区。这样构建成的重组分子既保留了结合抗原的功能，又消除了鼠源的免疫原性。这类人化抗体（humanhizedantibodies）也可称为重构抗体。为了构建这类抗体，首先需要测出MabV区的核苷酸序列，根据其中的CDRS序列，用全合成或点突变的方法将人Ig重构成MabV区的CDRS序列，然后将这种重构的V区基因与人IgC区基因连接，构成完整的人Ig基因，再于骨髓瘤细胞内表达。四、单链抗体用一编码亲水易折叠多肽的人工合成寡核苷酸，将重链V区（3ˊ）与轻链V区（5ˊ）端连接在一起（VH-linker-VL）即成单链抗体基因，将此基因克隆入原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达出的蛋白质即为单链抗体（singlechainantibodies）。它能自发折叠成天然构象，与抗原的结合力维持与原来完整抗体一样。五、免疫粘连素把细胞受体或细胞间粘附分子（intercellularadhesionmolcule,ICAM）与Ig的Fc段相连，即为免疫粘连素（immunoadhesin）。Staunton等制成一种含有可溶性细胞内粘附分子-1（1CAM-1）的免疫粘连素，它能有效地和特异的抑制被恶性疟原虫感染的红细胞对能产生1CAM-1表面的粘附。当被感染的红细胞与上述免疫粘连素结合后，Fc片段可促使单核细胞的吞噬作用。这种抗体可用于恶性疟疾的治疗。T细胞表面抗原CD4是爱滋病病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）的受体，在免疫预防和免疫治疗方面，免疫粘连素可能会提供一个新的途径。将Ig的Fc段与CD4形成的重组分子，可以中和HIV，但只是简单地结合会引起具Fc受体细胞的感染，而在体内具有Fc受体的细胞相应是多的，为此只有用定点突变或其他方法改变Fc段，使之不与Fc受体结合，便可有效地防治爱滋病。六、抗体基因文库的构建和基因表达筛选的表面呈现技术1985年Smith将一基因片段克隆到载体噬菌体fd-tet的基因Ⅲ（g3）上，发现该基因所表达的蛋白与噬菌体基因Ⅲ表达的蛋白结合在一起呈现到噬菌体表面。这种表达的融合蛋白仍保留抗原特异性和生物活性，可通过相应抗原进行检测。这样我们不仅可以利用噬菌体来构建基因文库，而且可以获得表达性的基因文库，无疑对高效率地筛选和富集目的基因提供了极大的方便。现在这一技术已被广泛地用于抗体基因文库，cDNA文库、随机多肽基因文库和突变基因文库的构建和筛选等诸多方面。丝状噬菌体表面呈现技术以丝状噬菌体为表达载体，目的基因插入到噬菌体外壳蛋白基因内，其天达产物呈现在噬菌体表面。Ff丝状噬菌体Ff丝状噬菌体呈柔性长丝状，直径约为6.5nm,野生型体长约为900nm。其基因组是一单链环状DNA，全序列已经测也，约含6000多个核苷酸，编码10种蛋白质。其中有5种蛋白组成外壳蛋白，基因Ⅷ（g8）在野生型噬菌体中约有2700～3000个考贝，它所编码的gp8蛋白是外壳蛋白的主要成分。它围绕基因组DNA以螺旋对称的排列构成圆管形的噬菌体外壳。除gp8外，不有4种少量的外壳蛋白：gp3、gp6、gp7和gp9，分别由基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ编码，它们各有5个拷贝。目的基因表达的蛋白如若想在噬菌体表面呈现，就必须插在这5种外壳的其中这一处。实验表明，在gp6、gp7、gp9中插入外源蛋白，都会影响其构成外壳蛋白的功能，而在gp8和gp3的N端插入外源蛋白后，形成的融合蛋白既可在噬菌体表面呈现，也不影响噬菌体的完整性和稳定性。成熟的gp8含有50个氨基酸，从构成外壳的功能来看可分为4个部分：（1）C端15个氨基酸偏碱性，与DNA相结合，构成外壳的内壁，在此处的突变将影响与DNA的相互作用。（2）25～35位肽段具有高度的疏水性，借此特性分子间相互聚合，形成固牢的外壳。这段肽链的改变将会影响噬菌体结构的稳定性。（3）从第6位的脯氨酸到C末端是连续的α螺旋结构，6～24位的螺旋肽段外露，在外壳上排列紧密，占据了噬菌体的大部分表面。如有稍大肽段插入，将会影响外壳的稳定性。（4）N端1～5位的氨基酸序列是丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-门冬氨酸-门冬氨酸（A-E-G-D-D），它外露于噬菌体表面，是外源肽段插入的最佳位置。利用这一系统可以构建表达性基因文库，称为噬菌体呈现文库。它最先被用于抗体基因文库的构建和筛选。虽然利用动物的免疫可以获得循环多克隆抗体，用细胞融合方法可以获得单克隆抗体，但利用基因工程的技术构建抗体基因库，再筛选所需的特异性抗生，不仅摆脱了繁重的工作量，也可获得大量的、稳定的抗体。而且随着研究的不断深入和发展，抗体的多样性，亲和力也大有提高。在构建噬菌体呈现抗体文库技术中，主要有3个特点：（1）可用抗原制备出免疫吸附剂，将文库的噬菌体与其反应，再经洗涤、洗脱得以捕获和纯化，将这种表达所需的特异性抗体的噬菌体感染大肠杆菌而得到繁殖。如此经过亲和结合→洗涤→洗脱→繁殖的富集过程，称为“panning”（淘选），一轮paning便可富集1000倍。如此简便、高效率，是其他方法比似的。（2）亲和力成熟过程可由体内转为体外。如前所述，抗原物质对动物机体的再次免疫，可获得高亲和力的抗体。这种在体内出现的亲和力成熟的现象，是由于细胞抗体基因在CDRS区域突变，再通过表面呈现技术加筛选，便可获得亲和力的特异抗体（3）这种方法不仅可以获得单链抗体，也可制备出重链、轻链结合的抗体（Fab）片段。外源基因编码的肽段在融合蛋白的N端，呈现在噬菌体表面时，C端锚着在膜上，N端是游离的，能够正确折叠，也可以形成二硫链。如果在插入基因与编码成熟gp8序列间放置amber终止码（TAG），则TAG就是蛋白质合成的终止信号，合成的多肽以非融合蛋白的形式分泌在内膜与细胞壁间的周质中，进而还能进入培养基中。利用这些特性，可将Fc蛋白锚着于细胞膜上，在周质中的分泌的轻链分子可与重链原位组装。形成完整的Fab片段积累在膜表面。