第三章基因工程工具酶

第三章基因工程工具酶1.限制性核酸内切酶2.连接酶3.DNA聚合酶4.反转录酶5.RNA聚合酶6.溶菌酶、蛋白酶K等一、基因工程工具酶的种类二、基因工程工具酶的来源•多数来自微生物或噬菌体感染的微生物•动物•病毒1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）:是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链的一个二磷脂键断裂的内脱氧核糖核苷酸酶．1.1限制性核酸内切酶的命名微生物的属名的第一个大写字母+种名的前两个小写字母+菌株（型）代号字母的缩写*EcoRI----Escherichiacoli中R型菌株提取的第一种内切酶（该基因位于Escherichiacoli中抗药性R质粒上）*HindIII-----Haemophilusinfluenzae中d菌株中提取的第三种限制性内切酶1.2限制性内切酶的种类目前在细菌中已发现600多种限制性内切酶，根据其性质不同可分为I、II和III等三大类．*I类和III类限制性内切酶同时具有核酸内切酶活性和甲基化活性，属于限制-修饰酶．*II类限制性核酸内切酶与所对应的甲基化酶是分离的，属于不同的酶分子，而且这类酶的识别切割位点比较专一，广泛应用于DNA的重组，被称为分子手术刀．1.3II类限制性内切酶的作用机制1.4限制性内切酶的识别序列二重旋转对称识别序列（二重互补对称）找出限制酶的识别序列识别序列越短，则在DNA序列中出现的几率就越大，识别序列越长，则出现的几率就越小．因此，在基因克隆中要根据不同的要求选择合适的限制酶．1.5限制酶识别序列出现的几率识别序列与出现几率的关系1.6多识别序列限制性内切酶能够识别两种或两种以上核苷酸序列内切酶．同裂酶：来源不同，但具有相同识别序列的限制酶．同位酶：具有相同的识别序列，但酶切位点不同的限制性内切酶．同尾酶：具有不同识别序列的限制性内切酶，切割DNA分子后产生相同的粘性末端.稀切限制性内切酶:由于限制性内切酶识别序列的特异性，识别位点在DNA分子上出现的几率特别低．1.7酶切末端5’粘性末端：限制性内切酶在二重对称轴的5’端切割DNA分子的每一条链，使得双链DNA分子交错断开，产生带突出的5’粘性末端的DNA片段．3’粘性末端：限制性内切酶在二重对称轴的3’端切割DNA分子的每一条链，使得双链DNA分子交错断开，产生带突出的3’粘性末端的DNA片段．平末端：限制性内切酶在二重对称轴的上切割DNA分子的每一条链，使得双链DNA分子断开，产生平末端的DNA片段．1.8限制性内切酶反应系统1）底物DNA分子：双链DNA分子的内部结构与限制性内切酶的反应效率密切相关．侧面序列：当识别序列两侧的碱基序列达到一定的长度时，限制性内切酶才能正常切割DNA分子的现象．位点偏爱：DNA分子中的某些识别序列能够迅速被限制性内切酶切割，而另一些位点则相对不易被切割的现象．DNA甲基化：DNA分子中的某些序列能够特异性地被甲基化酶所修饰的现象．DNA的甲基化不利于限制性内切酶的酶切作用．DNA的纯度：DNA样品中混杂的蛋白质，有机溶剂等会影响限制性内切酶的切割效率．DNA分子的浓度：DNA分子的浓度不能过高，否则会难于切动DNA分子．2）限制性内切酶的用量活性单位：酶在最适反应条件下，60min内完全切割1μgDNA的酶活性．容积活性：每1μl酶液中所含的酶活性单位．限制性内切酶的用量：不超过酶切反应总体积的1/10．内切酶储存缓冲液中含有50%的甘油，酶切反应系统中甘油的浓度高于5%时会影响限制性内切酶的酶切反应．4)酶切反应的缓冲液多数限制性内切酶的反应最适温度为37℃，但少数限制性内切酶的酶切反应温度高于或低于37℃．3)酶切反应的温度1.9限制性内切酶的Star活性某些限制性内切酶在特定的条件下，切割位点的识别序列发生变化．形成Star活性的因素包括：高浓度甘油、低离子强度等．1.10DNA分子的片段化单酶切法：以一种限制性内切酶切割DNA分子，酶切后获得N（识别位点）个或N+1个DNA片段．双酶切法：以两种限制性内切酶切割同一DNA分子．可同时酶切或先后酶切．部分酶切法：以限制性内切酶对DNA分子进行不完全切割．1.11DNA分子限制性内切酶酶切图谱DNA分子上各种限制酶识别位点的排列顺序．1)双酶切法：用三种以上待定位的限制性内切酶分别单酶切或双酶切DNA分子，测定各酶切DNA片段的大小，确定各酶切位点的相对位置．酶切片段分析2)末端标记DNA的部分酶切法原理：先以P32标记DNA分子的5’端，并以单切点的限制酶切割DNA分子，获得两个带标记的DNA片段，再以其它限制酶进行部分酶切，得到一系列DNA带标记的DNA片段，根据所得结果确定各种限制酶在DNA分子上的位置．3)Bal31核酸酶逐步降解法原理：利用Bal31外切酶从DNA片段的两端逐个切割核苷酸，使原切割片段在琼脂糖凝胶电泳谱上发生有规律的变化，从而确定某种限制酶在DNA片段上各个切割位点．2.DNA聚合酶DNA聚合酶：是一类催化DNA合成的酶类，酶的作用需要DNA或RNA作为模板，合成DNA链的序列与模板的序列互补。．2.1DNA聚合酶的种类1)几种常见的DNA聚合酶2.2几种DNA聚合酶的应用1)E.coliDNA聚合酶IA）以切口平移的方法标记DNA：在Mg2+的存在下，用低限量的DNA酶I处理双链DNA，产生的切口可作为大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）催化DNA合成的引物．合成过程中，dNTP前体不断掺入到正在增长的DNA链上，同时利用全酶的5’3’外切核酸酶活性使切口沿5’3’方向平移．如果提供放射性dNTP前体，则反应产物是被放射性标记的DNA链．切口平移法标记DNAB）对DNA分子3’突出尾端进行标记首先用3’5’外切核酸酶活性去除DNA的3’突出尾而产生3’凹端．然后在高浓度的放射性标记的核苷酸前体的存在下，外切酶降解反应与dNTP掺入3’端的反应达到平衡．该反应实际上是一个不断地从凹端或平端DNA上除去并置换3’端核苷酸的过程．利用DNA聚合酶I标记DNA的3’端2）E.coliDNA聚合酶I大片段（Klenow片段）A）来源：从蛋白酶从全酶中切除具有5’-3’外切酶活性的片段，只剩下聚合酶活性及3’-5’外切酶活性，目前作为商品提供的Klenow片段是通过枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I或通过克隆技术获得的单一的多肽链．B）应用*补平限制酶切割产生的3’凹端．*以[32P]dNTP补平DNA的3’凹端并进行标记．*对带3’突出端的DNA进行末端标记．*在cDNA克隆中用于合成cDNA的第二链．*在体外诱变中用于从单链模板合成双链DNA．3）T4DNA聚合酶A）补平或标记限制酶消化DNA后产生的3’凹端B）对3’突出端DNA分子进行末端标记C）将双链DNA的粘性末端转化为平末端4）T7DNA聚合酶A）用于拷贝长段模板的引物延伸反应B)通过补平或交换反应进行末端标记5）TaqDNA聚合酶从极度嗜热的栖热水生菌（Thermusaquaticus）中纯化而得．这些酶具有依赖于聚合作用的5’-3’的外切酶活性，对核苷酸的插入反应而言，该酶的具体作用温度取决于靶序列．最佳温度为75–80℃，温度为60℃时活性只剩下1/2，温度为37℃时，活性剩下1/10．但在许多情况下需要在低于最适反应温度的条件下起始聚合反应．A）体外扩增特定序列的DNA分子B）DNA测序：双脱氧核糖核苷酸法6）反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）A）种类目前有两种反转录酶，一种是来源于Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）反转录酶基因的表达产物；另一种是来源于禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶基因的表达产物．两者间存在差异如表．禽源反转录酶鼠源反转录酶组成亚基21最适反应温度42oC〈42oC最适pH值8.37.6B)应用将mRNA反转录成双链cDNA而后克隆到原核载体上．标记带5’突出端的DNA片段．用于双脱氧链终止法测序.3.依赖于DNA的RNA聚合酶SP6、T7、T3噬菌体可以合成依赖于DNA的RNA聚合酶，该酶能识别双链DNA上特异的启动子．1）合成单链RNA以作为杂交探针.2）表达克隆化基因.4.其它工具酶4.1DNA连接酶：催化两个单链DNA片段之间形成磷酸二酯键．1）种类E.coliDNA连接酶：需NAD+，连接互补粘性末端T4DNA连接酶：需ATP，连接互补粘性末端2）连接方式互补粘性末端连接：平末端连接：4.2碱性磷酸酶催化去除DNA，RNA，rNTP，dNTP的5’磷酸基团4.3BAL31核酸酶3’端核酸外切酶，可用于去除双链DNA的末端核苷酸及绘制DNA的限制酶图谱4.4S1核酸酶降解单链DNA或RNA，产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸．用于分析DNA：RNA杂交体的结构，去除DNA片段中突出的单链尾以产生平端，打开双链cDNA合成产生的发夹环．4.5核糖核酸酶A（RNaseA）特异地攻击RNA上嘧啶残基的3’端．用于去除DNA：RNA杂交体中的RNA，确定DNA或RNA中单碱基突变的位置．4.6脱氧核糖核苷酸酶I（DNaseI）优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA，产物为5’端带磷酸基团的单核苷酸或寡核苷酸．1）用切口平移法标记时，在双链DNA上产生随机缺口．2）建立随机克隆，用于M13噬菌体测序．3）分析DNA:蛋白复合物．4.7末端转移酶末端转移酶（Terminaltransferase,TdT）是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。4.8细胞裂解酶•溶菌酶•蛋白酶K、胰酶•纤维素酶思考题1.常用的工具酶有哪些？各有什么用途？2.什么是限制性核酸内切酶？3.什么是同裂酶、同位酶、同尾酶？举例说明。4.找出如下序列中可能的限制性内切酶识别位点：GGATATCCGCGACGTTAATATAGCTGCTAGCTACGATCG5.简述绘制DNA片段的限制性内切酶图谱的常用方法．Talen模块拼接