第三章基因工程的酶学基础

Geneengineering第三章基因工程的酶学基础Geneengineering第一节、限制性核酸内切酶第二节、ＤＮＡ连接酶第三节、DNA聚合酶第四节、其他酶Geneengineering一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶Geneengineering1、寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉GeneengineeringGeneengineeringE.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。Geneengineering作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶Geneengineering•限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。•根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：••Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶2、限制性内切酶的分类Geneengineering阿尔伯(1929～)1965年W.Arber（瑞士）首次从理论上提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶，并于1968年成功分离出I型限制性内切酶。1970年，美国分子生物学家、遗传学家H·O·Smith（史密斯）（1931～）分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学家D·Nathans内森斯（1928～）使用II型限制性内切酶首次完成了对基因的切割。他们的研究成果为人类在分子水平上实现人工基因重组提供了有效的技术手段，他们于1978年获得诺贝尔生理学或医学奖。Geneengineering分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅰ型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。Geneengineering这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24～26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。Ⅲ型酶Geneengineering分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。Ⅱ型酶Geneengineering主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+Mg2+SAMATP识别序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋转对称序列GAGCCCAGCAG切割位点距距识别序列1kb处随机性切割识别序列内或附近特异性切割识别序列下游24--26bp处Geneengineering第一个字母：大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号3、限制性核酸内切酶的命名原则例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶Geneengineering同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Haemophilusinfluenzaed属名种名株名嗜血流感杆菌d株HindIIHindIII1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIIIGeneengineering1.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；2.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。4、限制酶的特性Geneengineering二、Ⅱ型酶Geneengineering1、II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构GeneengineeringGeneengineering2.核酸内切酶作用后的断裂方式（1）粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。（2）平末端:两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。5´-端突出粘性末端3´-端突出5´AATTC3´Ｇ5´Ｇ3´ACGTCGeneengineeringEcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’GeneengineeringPstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’GeneengineeringSmaⅠ等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-G-G-C-C-C-C-T-C…5’GeneengineeringGeneengineering指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中有一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。3．同裂酶（isoschizomers)Geneengineering指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。4．同尾酶（isocaudamer）Geneengineering杂种位点（hybridsite）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点,一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCACCTAGGACTAGT杂种位点：TGATCC（BamHⅠ）（BclⅠ）ACTAGGGeneengineering（１）分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。5．限制片断的末端连接作用Geneengineering（2）分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子Geneengineering6.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件Tris--HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低盐酶NaCl0-150mM100mM中盐酶DTT1mM150mM高盐酶Volume20-100μlT37℃1-1.5h1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA所需的酶量Geneengineering对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸内切酶的多酶联合酶解：5‘…GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’Geneengineering（１）DNA的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等DNase的污染(Mg++)a.增加核酸内切限制酶的用量；b.扩大酶催化反应的体系（稀释）；c.延长酶催化反应的保温时间。d.加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度7．影响核酸内切酶活性的因素：Geneengineering（2）DNA的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC’3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG’3或5‘CCTGG’3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引入甲基GeneengineeringGeneengineering高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC’3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATTPyPy3’或者5‘AATT’3（3）核酸内切酶的缓冲液性质嘧啶碱基T/C嘌呤碱基A/GGeneengineering（4）酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度37度（5）DNA的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍Geneengineering（1）.氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变（2）.Tris-HCl：维持最适的pH值（pH＝7.4）（3）.β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性（4）.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性8．核酸内切限制酶标准的缓冲液Geneengineering（1）核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用（2）核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平9．核酸内切限制酶对DNA的消化作用Geneengineering小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-----多（基因文库）（3）核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用Geneengineering一、ＤＮＡ连接酶二、体外连接Geneengineering一、ＤＮＡ连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。1.ＤＮＡ连接酶的作用机理GeneengineeringGeneengineering磷酸酰胺键赖氨酸残基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键Geneengineering1)DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的2)T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的DNA连接酶－－NAD+T4DNA连接酶－－ATP2.连接酶的来源Geneengineering该酶常从Ｔ４噬菌体的受体细