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学士学位毕业论文学号:20104084112兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联灭活苗的研究和制备学生姓名:刘卫贞指导教师:余丽芸老师所在学院:生命科学技术学院专业:制药工程(1)中国·大庆2014年5月黑龙江八一农垦大学本科生毕业论文任务书论文题目兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联灭活苗的研究和制备学院名称生命科学技术学院姓名刘卫贞专业班级制药工程(1)指导教师余丽芸老师课题类型研究型毕业论文(设计)的内容摘要取攻毒后濒死兔或死亡兔的肝、脾、肾,经研磨、过滤、灭能制作兔病毒性出血症组织灭活毒液;用兔巴氏杆菌菌种接种在鲜血马丁琼脂(马丁肉汤),上制成菌液;将上述二者灭活后按比例混合,利用氢氧化铝胶作为佐剂,制成二联灭活苗。对产品进行无菌检验、安全试验和免疫效果检验,结果均合格。毕业论文(设计)基本要求及工作量要求一、基本要求:1.课题的任务、目的与意义。2.毕业论文的基本内容和方法。3.结论及对自己所完成任务的评价。4.其它需要说明的问题。二、工作量要求:正文字数在3000~5000字,查阅文献10篇以上,其中查阅与课题有关的外文文献2篇以上。毕业论文(设计)的主要阶段计划(分前期、中期、后期)前期:阅读文献,并对实验进行细致的设计,全面的计划好每一个步骤。中期:反复进行实验,使实验结果具有真实可靠性。后期:写实验报告,使实验结果形成一个系统的书面报告。任务下发日期2014.03.01完成日期2014.05.15系主任:主管教学院长审批(签字):兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联灭活苗的研究和制备摘要:取攻毒后濒死兔或死亡兔的肝、脾、肾,经研磨、过滤、灭能制作兔病毒性出血症组织灭活毒液;用兔巴氏杆菌菌种接种在鲜血马丁琼脂(马丁肉汤),上制成菌液;将上述二者灭活后按比例混合,利用氢氧化铝胶作为佐剂,制成二联灭活苗。对产品进行无菌检验、安全试验和免疫效果检验,结果均合格。关键词:兔病毒性出血症;巴氏杆菌病;铝胶;二联苗TheresearchandpreparationofthedoublevaccineofrabbitviralhemorrhagediseaseandpasteurellosisinrabbitAbstract:Inactivationtissueliquidweremadeusingtheliver,spleenandkidneyfromthedeathordyingrabbitschallengedwithrabbitHemorrhagediseasevirus.BloodMattin’sBrothorMattin’sagarosewasseededwithrabbitpasteurellosisinordertomadeinactivebacterial.ThesetwoinactivevirusandbacteriaweremixedinproportionandAl(OH)3wereaddedasadjuvant.Thisdoublevaccineweretestedbyasepsistest,securitytestandimmunitytest.Keywords:Rabbitviralhemorrhagedisease;Pasteurellosisinrabbit;gelatinalumina;thedoublevaccine目录前言....................................................................................................11材料和方法.......................................................................................11.1菌(毒)种...................................................................................11.2试验动物.......................................................................................11.3培养基.........................................................................................11.4氢氧化铝按常规方法制备..........................................................22疫苗的制备....................................................................................22.1菌(毒)液的制备....................................................................22.2疫苗配制.....................................................................................33疫苗的检验结果.............................................................................43.1无菌检验.....................................................................................43.2安全试验.....................................................................................43.3效力检验.....................................................................................44结论................................................................................................45讨论................................................................................................45.1.....................................................................................................45.2.....................................................................................................55.3.....................................................................................................55.4.....................................................................................................5参考文献............................................................................................6致谢....................................................................................................7黑龙江八一农垦大学毕业论文-1-前言兔病毒性出血症又名兔出血性肺炎、兔出血症和兔瘟。是由兔病毒性出血症病毒所致的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、致死性和以全身实质器官出血为主要特征的传染病。本病的主要传染源是病兔和带毒兔。传播途径主要由病兔或带毒兔与健康兔接触而感染,也可通过被排泄物、分泌物等污染的饲料、饮水、用具、空气、兔毛以及人员来往间接传播。本病发病急,病死率高,常呈暴发性流行,传播迅速,几天内危及全群。发病率和病死率均高达95%以上。潜伏期自然病例为2-3天,人工感染为1-3天[1]。兔巴氏杆菌病是一种多杀性疾病,急性病例引起患兔发生急性败血性疾病,发病率和死亡率均很高,因本病药物治疗效果不佳,兔场一旦发生巴氏杆菌病就很难根除,因此使用疫苗便成了控制本病的一条行之有效的办法。家兔中较常发生,一般无季节性。病兔的粪便、分泌物可以不断排出有毒力的病菌,污染外界环境,或由咳嗽、喷嚏排出病菌,通过飞沫经呼吸道而传染。临诊特征是鼻炎、地方流行性肺炎、全身性败血症、中耳炎、结膜炎、子宫积脓、睾丸炎等不同病型。此病是引起9周龄~6月龄兔死亡的一种最主要的传染病。做好以上二种疾病的预防工作,直接关系到养兔业的成败。过去是用单一苗,每苗一注,抓兔、打针对胆小的兔子是强烈的刺激。为了降低大批量的成本、减少捕捉注射次数、将对兔子的应激反应降到最低,开展了以氢氧化铝为佐剂的兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联灭活苗的研究和制备工作。这样,既简化了制作过程,又降低了成本,也为现地应用节省了人力和物力。1材料和方法1.1菌(毒)种兔病毒性出血症病毒毒种、兔巴氏杆菌冻干菌种均由黑龙江省生物制品一厂提供。1.2试验动物非免疫兔由黑龙江省哈药生物疫苗试验动物室提供。1.3培养基[2]鲜血马丁琼脂、马丁肉汤。1.3.1鲜血马丁琼脂培养基配方及制法培养基主要成分有牛肉汤500ml,猪胃消化液500ml,氯化钠2.5g,琼脂粉12g。将上述成分混合,加热溶解,待琼脂完全溶化后,加氢氧化钠溶液调整黑龙江八一农垦大学毕业论文-2-PH为7.4-7.6以卵白澄清法或凝固沉淀法除去沉淀,分装于试管或中性玻璃瓶中,116℃灭菌30-40min。灭菌后PH值应为7.2-7.6。根据需求在上述琼脂液冷却至53-55℃时,加入4%健康动物血清0.1%裂解血球全血,充分混合后,分装于灭菌平板或试管中,制成含4%健康动物血清和0.1%裂解血的鲜血马丁琼脂。1.3.2马丁肉汤培养基的配方及制法培养基主要成分有牛肉汤500ml,猪胃消化液500ml,氯化钠2.5g。将上列成分混合后,以氢氧化钠溶液调整pH为7.6-7.8,煮沸20-40min,补足失去的水分.冷却沉淀,抽取上清液,经滤纸或绒布滤过,滤液应为澄清、淡黄色,按需要量分装,经116℃灭菌30-40min,灭菌后pH值应为7.2-7.6。1.4氢氧化铝胶的制备制备氢氧化铝胶的时候,选用三氯化铝与氢氧化钠合成的方法[3]。其反应原理的化学反应式为:AlCl3+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl。制造时,先将无水三氯化铝用去离子水配成25%溶液,加热溶化,使用时再稀释成8%,加温至56-60℃。另将氢氧化钠配成4%溶液,加温至56-60℃。化学合成时,将三氯化铝溶液放入反应缸,维持温度60℃,边搅拌边缓慢加入氢氧化钠溶液,当化合液pH达到5.6-6.0时,即为终点,继续搅拌10min,分装,121℃高压灭菌30min,灭菌后的铝胶液为透明略带乳光液体,pH5.5±0.1。此法合成的铝胶虽然含量低,但胶体透明无沉淀,目前广泛用于制备人用生物制品,认为佐剂效果良好,注射部位无硬结反应。2疫苗的制备2.1菌(毒)液的制备2.1.1兔病毒性出血症组织灭活液的制备(1)兔病毒性出血症病毒在兔体内的增殖为了获得高滴度病毒组织,应选择体重1.5Kg以上健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