系统生物学-第三讲-转录组学

第三讲转录组学主要内容•RNA的种类和作用•RNA研究方法•高通量技术研究转录组学的策略•转录组学研究进展•microRNA研究RNA是解读基因组的关键RNAProteinPhenotypeGenotypeDNA转录（transcription）生物体以DNA为模板合成RNA的过程。转录RNADNA•转录（Transcription）：遗传信息由DNA转换到RNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是mRNA以及非编码RNA（tRNA、rRNA等）的合成步骤。•以特定的DNA片段作为模板，以DNA依赖的核糖核酸聚合酶（RNA聚合酶或RNA合成酶）作为催化剂而合成前mRNA的过程。•mRNA转录时，DNA分子双链打开，在RNA聚合酶的作用下，游离的4种核糖核苷酸按照碱基互补配对原则结合到DNA单链上，并在RNA聚合酶的作用下形成单链mRNA分子。•转录本：transcript。也称为剪切体。一条基因通过不同剪接可构成不同的转录本。参与转录的物质原料:NTP（ATP,UTP,GTP,CTP）模板:DNA酶:RNA聚合酶（RNApolymerase,RNA-pol）其他蛋白质因子一、RNA的种类和作用•1.RNA的种类•2.各类RNA的作用RNA的常见种类•1.核糖体RNA（rRNA）•2.转运RNA（tRNA）•3.信使RNA（mRNA）RNA的其他种类•1.不均一核RNA（hnRNA）•2.小核RNA（snRNA）•3.核仁小RNA（snoRNA）•4.小胞质RNA（scRNA/7s-RNA)•5.microRNA•6.转移-信使RNA（tmRNA）•7.端粒酶RNA•8.反义RNA•……核糖体RNA（rRNA）1.rRNA是核糖体的组成成分rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome)如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。2.定位（起始翻译）16S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这有助于mRNA与核糖体的结合，进而起始翻译。•核糖体RNA，原核生物包括5s，16s，23s，真核生物包括5s，5.8s，18s和28s，而每种rRNA各自有各自的功能。转运RNA（tRNA）在蛋白质合成中作为氨基酸的载体合成i蛋白质的原材料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，必须用一种特殊的RNA——转运RNA（tRNA）把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地把它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。信使RNA（mRNA）作为蛋白质合成时的模板mRNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链。其功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，完成翻译，合成蛋白质。不均一核RNA（hnRNA）•概念：在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。而因为未经加工的前体mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差别很大，所以通常称为不均一核RNA。•hn-RNA在受到加工之后，移至细胞质，作为mRNA而发挥其功能。而大部分的hnRNA在核内与各种特异的蛋白质形成复合体而存在着。小核RNA（snRNA）•概念：小核RNA，也见译为核内小RNA，是含有100到300碱基的RNA，它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体的主要成分。•功能：它参与真核生物细胞核中RNA的加工。snRNA和许多蛋白质结合在一起成为小核核糖核蛋白，参与信使RNA前体（也就是hnRNA）的剪接，使后者成为成熟mRNA。核仁小RNA（snoRNA）概念：核仁小分子RNA是一大类RNA分子，其大小一般在几十到几百个核苷酸，它们能与特定的蛋白质（如自身免疫抗原等）相结合生成snoRNP，在细胞中稳定存在，并且富集于核仁区，所以被称为核仁小分子RNA。功能：负责rRNA的加工（切割和修饰），参与核糖体的生物合成。小胞质RNA（scRNA/7s-RNA)•存在于细胞质中的小RNA分子（如信号识别颗粒组分中含有的7sRNA）,是蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成。小RNA分子•有些小RNA分子能直接调控某些基因的开关从而控制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型•小RNA分子本身又包含了若干类RNA，根据小RNA的生成、结构和功能大约可分为以下三类：•miRNA（microRNA)•siRNA(smallinterferingRNA)•其他小RNAmicroRNA•概念：MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。不同于siRNA，但是和siRNA密切相关。•功能：microRNA通过与相应的蛋白结合，形成一个“RNA诱导的转录沉默复合体”。该复合体主要有4个作用：1.降解靶mRNA；2.抑制mRNA的翻译；3.在细胞核内募集组蛋白脱乙酰化酶等因子，沉默DNA的表达；4.扩增相应的microRNA。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡，脂肪代谢和细胞分化。•第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程。继线虫之后，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。转移-信使RNA（tmRNA）•tmRNA是一类具有类似tRNA分子和mRNA分子双重功能的小分子RNA，它在一种特殊的翻译模式――反式翻译模式过程中发挥重要作用。最近又发现它与基因的表达调控及细胞周期的调控等生命过程密切相关。•反式翻译是细菌体内一种修复翻译水平上受阻的遗传信息表达过程的机制。端粒酶RNA•端粒酶是一种逆转录酶，是染色体端粒的RNA序列。功能：端粒酶是真核生物端粒复制的模板，它可以使用其部分RNA作为模板来合成端粒重复单元。在大多数真核生物中，染色体末端DNA的逐步丢失会被端粒酶所抑制。在具有端粒酶活性的细胞内，它的任务是作为反转录的模板然后加在端粒的末端以解决染色体因复制而变短的问题。这种酶在大多数细胞里是没有活性的，但在某些肿瘤细胞，转化细胞，干细胞以及生殖细胞里活性较高。反义RNA(antisenseRNA）•反义RNA(antisenseRNA)，可通过与靶位序列互补而与之结合的RNA，或直接阻止靶序列功能,或改变靶部位构象而影响其功能。RNA分析方法•mRNA检测技术–核酸杂交技术–原位杂交–逆转录PCR(ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)–RACEnorthernblot•放射性同位素标记物α-32P-dCTP灵敏度达0.01pg•非放射性标记物地高辛灵敏度达0.1pgDIG-dUTP-----通过酶促反应掺入到DNA/RNA中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶的复合物—加底物—显色探针制备探测不同条件下的基因表达变化B.WITEK-ZAWADA,200328SrRNA18SrRNA•FISH：FluorescenceInSituHybridization原位杂交原位杂交MorozLL,2006RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR转录本AlltranscriptsAllmRNAsDNARNA蛋白质基因组学RNA组学蛋白质组学转录组•转录组概念由Velculescu等在1995年首次提出。•转录组：广义上指一个细胞内基因组DNA转录得到的所有转录产物以及转录物在细胞特定发育时期或特定生理条件下的表达水平，包括编码RNA（mRNA）和非编码RNA（如tRNA、rRNA、snRNA、miRNA等），狭义上指所有mRNA的集合。•转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，是解读基因组功能原件和揭示细胞及组织分子组成所必需的。•转录组的特点：受到内外多种因素的调节，因而是动态可变的。能够揭示不同物种、不同个体、不同细胞、不同发育阶段及不同生理病理状态下的基因差异表达信息。•转录组学（Transcriptomics）：研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数；比较不同功能状态下mRNA表达的变化，搜寻与功能状态变化紧密相关的重要基因群。转录组研究的主要目的•发现所有转录本种类•确定基因结构•确定基因表达•发现差异表达基因转录组测序技术主要包括:表达序列标签（EST）表达系列分析（SAGE）基因芯片(Chip)高通量测序技术(NGS)转录组测序•RNA_Seq的重要分支•RNA_Seq是指针对转录产物RNA的测序技术，主要有以下分支：•转录组分析•表达谱分析•小RNA分析•降解组测序•针对mRNA的测序•转录组测序是针对特定样品特定时期的转录mRNA的测序技术，重点在对翻译蛋白的mRNA的测序研究。转录组测序的特点•应用对象灵活广泛•针对不同物种，不同个体，不同时期，都可以在mRNA水平准确的分析性状或功能差异，结构变异等信息。•研究范围多样化•从未知基因组物种，到研究成熟的人体病变组织，小鼠组织等特异组织，均可通过转录组分析进行研究。•研究深度多样化•从大规模功能转录本发掘到特定基因的可变剪接的不同功能分析，都可以定位研究。表达序列标签(EST)测定及分析1、什么是EST?2、EST的应用3、EST序列测定及分析过程(2)什么是表达序列标签?（expressedsequencetag,EST）从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5′末端或3′末端进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。基因组表达为RNA的序列:mRNA和功能RNA1、表达序列与表达序列标签概念(1)什么是表达序列?EST的获得途径cDNA文库构建•非标准化的cDNA文库的构建。（可用于基因表达量的分析）•◆经标准化或扣除杂交处理的cDNA文库。（富集表达丰度较低的基因）•◆Oligod(T)cDNA文库。•（非翻译区由于不含有编码序列，与编码区保守序列相比所受到的选择压力比较小，因而其多态性程度比较高，便于多态性位点的选择以用于遗传图谱的构建。）•◆随机引物cDNA文库。•（所获得的EST在基因功能的鉴定时具有更多的信息含量，并且在构建EST数据库时更有优势，同时有利于利用EST数据库聚类完整的基因和阅读框的寻找，便于利用更敏感的蛋白质比较来寻找同源基因。）cDNA文库构建常见问题•RNA得率低•mRNA分离效率低•cDNA产物少原因：多糖、多酚、内源性核酸蛋白酶、miRNA等原因•多糖-糖蛋白(核酸蛋白酶，植物血凝素等)、多酚类等次生代谢产物在RNA分离时，经常与RNA共沉降，导致RNA丢失。或导致分离后的RNA严重不纯，影响mRNA分离的得率。•内源性核酸酶存在较多的情况下，可降解双链DNA、RNA或者DNA-RNA杂合体，致使RNA易降解，转录后的DNA接头无法连接，是cDNA得率低的原因之一。•miRNA的存在导致mRNA的降解大规模EST序列测定的开始1983年：Costanzo等提出EST概念的雏形1991年：Adams测定了三种人脑组织共609条EST，宣布了cDNA大规模测序的时代的开始代1991年：Okubo等提出大规模cDNA测序的研究战略1993年：Venter等创立现在的EST技术1993年：Boguski&Schuler提出以EST为界标的人类基因组转录图谱计划●●93年前ESTs数据收录于GenBank，EBI和DDBJ。●1993年NCBI(NationalCenterofBiotechnol