观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征

观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征实验目的1.初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各操作步骤的原理。2.观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征；3.认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组型图实验原理(一)制作染色体标本的先决条件：1.细胞具有旺盛的分裂能力（a.选择活跃的组织如睾丸，骨髓。b.施加药物使细胞分裂如PHA）2.设法得到大量中期细胞，秋水仙素处理。3.染色体特征：1.数目（2n=？）2.长度（绝对长度、相对长度）3.着丝粒位置（M\SM\ST\T）4.随体与次缢痕的数目、大小和位置5.带型分析(二)操作方法利用睾丸细胞的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂。由于小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。减数分裂是细胞分裂染色体数目减半时发生在性细胞的形成过程中。哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点：①用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处；②用低渗法使细胞膨胀,以至于在滴片时细胞胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上；③空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。(三)中期染色体的特征1、突出在纺锤丝的牵引下，染色体的着丝点集中到细胞中央的道板上；2、DNA高度螺旋化。短粗的染色体清晰可见，染色体数目形态稳定，便于观察；3、由于染色体高度集中，造成纺锤体清晰可见。通过本实验的结果看，本实验要想做的较好不太容易，需要娴熟的技术和耐心。(四)原理分析通过获取小鼠睾丸细胞（分裂能力强），本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。一般观察有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。实验用品1.材料小白鼠2.试剂：秋水仙素、生理盐水（0.9%的NaCl溶液）、0.3%KCl低渗溶液、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液3.器材：解剖盘、解剖镊、解剖剪、小烧杯、吸管、玻璃刻度离心管、恒温水浴锅、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等实验步骤预处理→取睾丸→剪碎→离心→低渗→离心→固定→离心→固定→滴片→染色→观察（一）小白鼠染色体标本制作1．预处理：取雄性小鼠按每克体重注射4ug，给小白鼠注射秋水仙素，经14-16h后，断头法杀死小鼠，去除睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污2．放入装有1ml0.3%KCl液的小烧杯中剪碎（呈乳白色）3．用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml4．37℃静置30min，进行低渗处理5．离心：800-1000r/min离心8min,弃上清6．加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8min；7．再以800-1000r/min离心8min；8.弃去上清液，加1ml固定液，制成细胞悬液固定5min9.取清洁的低温预冷载片，距10-15min高度滴下2-3滴细胞悬液，从一边轻轻吹气并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促进染色体展开10.用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥后染色20-30min（二）小白鼠染色体标本染色与观察1.倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架，使标本载玻片的标本面向下放置到支架上，在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液。目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。2.用Giemsa染色20～30分钟，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。3.镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。注意事项（一）实验操作1.低渗时不能使细胞因吸水而涨破，但也要保证浓度和时间，以免染色体不能展开。2.离心要控制在800-1000r/min，过大会使细胞涨破，导致实验失败，时间也要控制，过长也会影响观察3.固定时间要足够，固定作用不足，染色体形态不清晰。4.滴片要保证至少10-15min高度，滴三滴后轻轻吹气和敲打，目的在于使细胞均匀分布和促进染色体展开。5.染色采用倒置染色法，可使载玻片充分接触染液，使杂质可沉降至底部。（二）观察标准1．细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上；2．染色体形态和分布良好，最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错；3．所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段（分裂中期），即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样，在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响观察和计数。实验结果A图染色体40条；B图染色体36条。结果分析与讨论1.视野中有较多的精细胞影响观察，更有许多没有涨破的细胞。可能由于加入固定液不够，低渗时间也不够，而且温度上也过低。2.染色体没有分散开，较多染色体凝聚成团状，影响了观察计数，可能由于滴片距离不足，细胞吹散和摔打工作没有做好。3.处于分裂中期的细胞数量太少，导致很难找到中期染色体。可能是低渗时间，滴片高度，秋水仙素处理的时间和用量等因素的影响。4.A图染色体约为40个，染色体展开程度较差，成球状，但易于计数；B图染色体展开程度比前者大，可观察到u型及v型染色体，但染色体数目约为36条（有重叠难以准确计数），存在染色体丢失现象，可能是在吹打的过程中丢失的。BA