第三章第二节基因工程载体

第二节基因工程的载体种类:质粒噬菌体腺病毒载体逆转录病毒载体等质粒载体•一、质粒的一般生物学特性•二、质粒DNA的分离与纯化•三、质粒载体的构建及类型•四、常用质粒载体举例一、质粒的一般生物学特性（一）、质粒DNA1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。3、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。4、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环DNA（ocDNA），线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。（二）、质粒的拷贝数与不亲和性1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。二质粒DNA的分离与纯化•常规的方法:煮沸裂解法SDS裂解法碱裂解法三、质粒载体的构建及类型•（一）质粒载体的发展概况；•（二）质粒载体的特点（基本条件）；•（三）遗传标记基因•（四）质粒载体的类型（一）发展概况1.第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。（二）载体特点1、至少有一个复制起点2、至少应有一个克隆位点。3、至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。注：前三个特点必不可少。pBR322BamHISalIHindIIIPstIScaIAmprori(4.36kb)（三）遗传标记基因1、标记基因的作用1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞这种指示可以是选择性的（Ampr，Tetr，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。*这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS，lacZα），绝大多数为后者。**有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。2、标记基因的种类1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr，Strr2）生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ3、常用的遗传标记基因及其作用机制1)四环素抗性基因（Tetr，Tcr）Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2)氨苄青霉素抗性基因（Ampr，Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨苄青霉素失活。3)氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体50S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZα-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。β—半乳糖苷酶基因的优点:a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观b.lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大PLacZαLacZβ转录翻译αβLacZ基因的结构与产物pUC18BamHI片段重组DNA分子转化E.coli外源DNABamHI片段涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落为重组子，兰色菌落为原载体利用LacZ基因筛选重组子（四）、质粒载体的类型1、根据载体的分子生物学特性划分（1）.质粒型载体:环状dsDNA分子，自主复制（2）.病毒型载体:环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒（3）.混合型载体:具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性2、根据载体功能划分（1）.普通型载体(1)特点:至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。(2)用途:基因组或cDNA文库的构建;亚克隆(subcloning)或限制酶谱分析；外源DNA扩增。例子:pBR322和pUC载体。上述两例中的非重组子来源有两个：a.酶切反应时仍未被作用的pBR322或pUC18分子b.酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子普通型载体pBR322的结构图pBR322BamHISalIHindIIIPstIScaIAmprori(4.36kb)pUC18和pUC19载体EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRIIIIHIIIIIdIIIpUC18pUC19HinSphPstSalXbaBamSmaKpnSacEcodIIIIIIIHIIIIRIApOriLacZ(2.68kb)r（2）、表达型载体（expressionvector）1)特点:a.基因的启动子序列和终止子序列；b.一般无检测标记基因；c.克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；d.重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。2)结构:a.转化单元--宿主细胞转化b.表达单元--外源基因表达3)类型:Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子Ⅱ型:转录起始区+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子Ⅲ型:转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）显然,不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定,表达载体的类型也就确定了。4)用途:a.表达外源基因以产生大量外源基因产物b.用于构建cDNA文库三种表达型载体结构图TAAATGIIIIIIIVVIVIIIVATGIIIIIIVIIIIIIOri转录起始翻译起始信号肽成熟蛋白质转录终止区CSCSCSCS--cloningsite四、常用质粒载体举例1、pBR322载体2、pUC载体1、pBR322载体优点：1、分子量较小，为4363bp。2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。pBR322BamHISalIHindIIIPstIScaIAmprori(4.36kb)BamHI片段(Tcr)pBR322PstI(Apr)片段重组分子I重组分子Ⅱ(ApsTcr)(AprTcs）PstI片段外源DNABamHI片段重组分子I涂布Ap平板Apr转化子分别转化E.coli(ApSTcS)重组分子Ⅱ涂布Tc平板Tcr转化子影印到Tc平板上AprTcS为重组子AprTcr为原载体影印到Ap平板上ApSTcr为重组子即为非重组子利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程2、pUC18和pUC19pUC系列质粒载体具有三个显著特点：（1）、分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。（2）、含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）、多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。pUC18和pUC19载体EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRIIIIHIIIIIdIIIpUC18pUC19HinSphPstSalXbaBamSmaKpnSacEcodIIIIIIIHIIIIRIApOriLacZ(2.68kb)r分子克隆载体的选择1.选择克隆载体的几个重要参数（1）实验对象（2）实验性质（3）载体容量（4）合适克隆位点（5）载体的稳定性（6）载体DNA制备的难易（7）外源基因表达产物产量、产物特点等2.实验对象（1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。（2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如：E.coliDH5、E.coliDH5α、E.coliDH5αF’1）三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组2）DH5α和DH5αF’都具有一个可供遗传标记lacZα检测的遗传背景3）DH5αF’可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要F’的存在3.实验性质分子克隆的一般程序包括以下几步：（1）分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA（2）构建基因文库或cDNA文库（3）目的基因或cDNA克隆的筛选（4）目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等（5）基因表达与调控机理的研究1)建立文库用载体常在E.coli进行i.目的基因与供体基因大小小—质粒载体，操作方便，鉴定简单大—λ或cos质粒载体,甚至pYAC载体(为减少文库规模，即使基因组小的也可用λ和cos载体）ii.筛选方法ⅰ)互补法：可表达,选一般载体;不表达，选表达载体(外源基因必须表达，表达产物必须具备活性)ⅱ)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性ⅲ)杂交法：各种载体均