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第九章基因重组与基因工程GeneRecombinationandGeneticEngineering转基因植物获得新的性状把大鼠生长因子转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。用噬菌体DNA构建重组DNA分子用质粒构建重组DNA分子基因重组(generecombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。基因工程(geneticengineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。重组DNA技术重组DNA技术又称为基因工程（geneticengineering）或分子克隆(molecularcloning)。基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：①载体和目的基因的分离；②载体和目的基因的切断；③载体和目的基因的重组；④重组DNA的转化和扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。一、载体和目的基因的分离为了进行基因重组，首先需要对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。（一）载体：基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。1．质粒：是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。质粒pUC19的分子结构2．噬菌体：可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。3．病毒：常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。（二）目的基因：目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：1．直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。2．人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。3．从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。4．从基因文库中筛选：将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomicDNAlibrary)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNAlibrary)。C-文库具有组织细胞特异性。基因组文库的制作5．利用PCR合成：如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。二、载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesiveend)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。三、载体和目的基因的重组即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。（一）粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。载体DNA与目的基因的连接（二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。（三）人工接头连接法：将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。四、重组DNA的转化和扩增重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒DNA短暂温育，质粒DNA即可导入宿主细胞。如果是用λ噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfection)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对于质粒DNA，还可通过在培养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体DNA的复制，以单独扩增细胞中的质粒DNA。五、重组DNA的筛选和鉴定由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：（一）根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。插入灭活法筛选重组体（二）根据标志互补进行筛选：当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。（三）根据DNA限制酶谱进行分析：经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。五、转基因技术1982年Palmiter等人首次将大白鼠的生长激素基因放在质粒中小白鼠金属巯基蛋白启动子之后。这个启动子通常在染色体上，控制金属巯基蛋白的转录。将重组好的这种质粒（几百个拷贝）用特制的微量注射器注入小鼠受精卵的雄性原细胞核（pronucleus）中，再将这个受精卵植入小鼠子宫中。结果发育生成的小鼠中经Southen杂交证明许多小鼠中都含有大白鼠的生长激素基因。而且成熟的小鼠体重比对照大两倍，成为“硕鼠”或“超级鼠”。这个实验首次证明，外源基因在新的启动子控制下可以整合到哺乳类细胞核内，并在其中实现有效地表达。转基因技术中有关外源基因与染色体的定位重组，表达调控等还有待深入研究。六、体细胞克隆技术1997年Nature杂志报导，英国学者I.Wilmut等人，从一只胚胎羊中取出乳腺上皮细胞进行培养（供体），再用另一母羊的卵细胞（受体）摘出细胞核后，与上述乳腺上皮细胞进行体外融合。融合体经培养后，植入受体母羊的子宫中，结果融合体发育并分娩出一头小羊“多利”。称为克隆羊。这是20世纪生物科学震惊世界的成就。它表明成熟的体细胞可以不经过有性繁殖发育成个体。