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基因工程疫苗宁夏医科大学检验学院郭乐（博士/讲师）2014/3/18第一节疫苗概述一、疫苗的起源与发展疫苗的起源可以追溯到我国古代。早在4世纪初，东晋葛洪所著《肘zhou后方》中，已有关于防治狂犬病的记载：“杀所咬犬，取脑敷之，后不复发”在宋真宗时代（公元1000年左右）宰相王旦之子患了天花，四处请医无效，最后请来了峨眉山的道人，取其患处的结痂jia，处理后进行自体接种而治愈，这当是最早的自身免疫治疗（self-Vaccine）。逐渐发展成了预防天花的人痘接种法，即从感染天花后的恢复期病人或症状比较轻的病人身上，挑取水泡、脓疱和痘痂内容物并保存1个月左右待其干燥，然后将其研磨成粉末，给健康人的鼻腔吸入，以预防天花，取得了很好的保护效果。这是人类史上最早使用疫苗来预防疾病的记录，较英国医生琴纳（Jenner）发明牛痘苗早了几百年。15世纪中期我国的人痘苗接种法传至中东，后经改革进行皮下接种。1721年英驻土耳其的大使夫人，将此法传至英与欧洲各国。人痘的发明是中国人民对世界医学的一大贡献。2000年，美国疾病控制与预防中心（CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC）出版了《疫苗可预防疾病的流行病学与预防学》第6版，在这本被誉为疫苗学权威手册首页的“疫苗接种的里程碑”中，第一项即是“12世纪中国开始用人痘接种预防天花”（见表6-1）。这是对中国首先开始使用人痘接种预防天花是最早的免疫接种形式的肯定。表5-1疫苗发展史上的里程碑事件时间事件12世纪中国开始用人痘接种预防天花1721年人逗接种传入英国1796年E.Jenner为JamesPhipps接种牛痘，疫苗接种正式开始1870L.Pasteur发明了第一个细菌减毒活疫苗——鸡霍乱疫苗1884年L.Pasteur发明了第一个病毒减毒活疫苗——狂犬病疫苗1885年L.Pasteu第一次把狂犬病疫苗接种于人体1901年VonBehring发现了白喉抗毒素，获得第一个医学诺贝尔奖1909年Smith发明了灭活白喉毒素的方法1909年Calmette和Guerin发明了第一个用于人的细菌减毒活疫苗BCG1933年GoodPasture发明了鸡胚病毒培养法1949年Enders及其同事从人细胞系中分离出脊髓灰质炎Ⅱ型Lancing株1954年Enders分离出麻疹病毒1955年脊髓灰质炎灭活疫苗获准生产时间事件1961年人二倍体细胞株建立1963年麻疹疫苗获准生产三价脊髓灰质炎疫苗获准生产1966年世界卫生联盟呼吁全球消灭天花1977年索马里发现最后一例本土天花1979年美国报道最后一例野毒传播型脊髓灰质炎1986年第一个重组疫苗——重组乙型肝炎疫苗获准生产1989年推荐使用二剂型麻疹疫苗1990年第一个多糖结合疫苗——B型流感嗜血杆菌疫苗获准生产1991年西半球报道最后一例野毒株脊髓灰质炎病例乙型肝炎免疫纳入全球计划免疫1994年美国消灭脊髓灰质炎得到证实1995年水痘疫苗获准生产1996年用于婴儿的无细胞型百日咳疫苗获准生产1997年推荐进行扫荡式脊髓灰质炎免疫1999年推荐单一使用脊髓灰质炎灭活疫苗2000年用于婴儿的结合肺炎球菌疫苗获准生产引自：CDC：EpidemiologyandPreventionofVaccine-preventableDisease.6Edition，2000痘衣法人痘接种法之一。取天花患儿贴身内衣，给健康未出痘的小儿穿着二三天，以达种痘之目的。一般在着衣九至十一天时始发热，为种痘已成，此法成功率低。若成功者，发热、出痘证候较缓，不致发生危险。痘浆法人痘接种法之一。即天花患儿的新鲜痘浆，以棉花蘸塞入被接种对象的鼻孔，以此引起发痘，达到预防接种的目的。因本法需直接刺破儿痘，病家多不愿接受，故在古代亦较少用。旱苗法痘接种法之一。取天花痘痂研极细末，置曲颈根管之一端，对准鼻孔吹入，以达种痘预防天花的目的。一般至七日而发热，为种痘已成。此法以其简便而多用，但因苗入刺激鼻粘膜，鼻涕增多，往往冲去痘苗而无效，后多不用。水苗法人痘接种法。取痘痂20-30粒，研为细末，和净水或人乳三、五滴，调匀，用新棉摊薄片，裹所调痘苗在内，捏成枣核样，以线拴之，塞入鼻孔内，12小时后取出。通常至七日发热见痘，为种痘成功。此法为我国古代人痘接种法中效果最好的。可达到预防天花的目的，即便发病，亦可起到减轻病情，避免产生危重的病情。1796年5月17日，是琴纳47岁生日，他的候诊室里一清早聚集了很多好奇的人。屋子的一张椅子上，坐着一个八岁的男孩菲普士，正吃着糖果。不久，一位包着手的女孩来了，她是挤牛奶的姑娘尼姆斯，几天前从奶牛身上感染了牛痘。琴纳要大胆地实施一个计划：把反应轻微的牛痘接种到健康人身上去预防天花。琴纳用一把小刀，在男孩左臂的皮肤上划了一条小痕，然后从尼姆斯手上的痘痂里取出一点点脓浆，接种到菲普士划破皮肤的地方。两天后，男孩感到有些不舒服，但很快就好了。菲普士顺利地挨过了牛痘“关”。现在摆在琴纳面前最主要的事情是：证明菲普士今后再也不会传上天花。如果真是这样的话，牛痘的接种就是真正成功了！过了一些时候，琴纳从天花病人身上取来了一点痘痂脓液，接种在菲普士身上。然而，两个星期过去了，菲普士依然很健壮。以后，琴纳又做了一批试验，进一步证实了牛痘预防天花的作用。牛痘接种法的创始人爱德华·琴纳1882年，巴所德被选为法兰西学院院士，同年开始研究狂犬病，证明病原体存在于患兽唾液及神经系统中，并制成咸毒活疫苗。在细菌学说占统治地位的年代，巴斯德并不知道狂犬病是一种病毒病，但从科学实践中他知道有侵染性的物质经过反复传代和干燥，会减少其毒性。他将含有病原的狂犬病的延髓提取液多次注射兔子后，再将这些减毒的液体注射狗，以后狗就能抵抗正常强度的狂犬病毒的侵染。1885年人们把一个被疯狗咬得很厉害的9岁男孩送到巴斯德那里请求抢救，巴斯德犹豫了一会后，就给这个孩子注射了毒性减到很低的上述提取液，然后再逐渐用毒性较强的提取液注射。巴斯德的想法是希望在狂犬病的潜伏期过去之前，使他产生抵抗力。结果巴斯德成功了，孩子得救了。巴斯德在1889年发明了狂犬病疫苗，他还指出这种病原物是某种可以通过细菌滤器的“过滤性的超微生物”。1796.5.14英国乡村医生爱德华·琴纳（EdwardJenner）进行了人类历史上的第一次疫苗接种试验。Jenner从一位感染了牛痘的年轻挤奶农妇的手上挑取了痘苗接种到一名8岁男孩的手臂上。经过几个月的严密观察，发现小男孩获得了免疫保护，一直没有感染天花。1798年9月，Jenner发表了接种“牛痘”预防天花的论文，虽然当时全然不知天花是由天花病毒感染所致，但这一划时代的发明，开创了人工自动免疫的先河。随后，种痘技术传遍了欧洲，后又传到北美和亚洲。为纪念Jenner的这一伟大贡献，巴斯德(Pasteur)将疫苗称为Vaccine（拉丁文vacc是“牛”的意思）。由于长期和广泛地使用牛痘苗，全世界从1977年以后再也没有发现过天花病人。世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）于1979年10月26日庄严宣布，天花已在全球绝迹。这是人类历史上第一个使用疫苗消灭的传染病。19世纪70年代，法国科学家路易斯·巴斯德(LouisPasteur)有关减毒鸡霍乱菌的研究，是继琴纳之后的重大进步。他认为使用减毒的病原体来预防其导致的疾病，比使用相关的动物病原体来预防人类疾病理当更加有效。巴斯德建立了现代意义上的预防接种，即通过实验室内研制的疫苗来预防传染病。随后的羊炭疽减毒活疫苗的试验成功，尤其是1885年首次在人体使用减毒狂犬病疫苗的成功，标志人类进入了一个预防接种的科学新纪元。基于安全原因，正式生产的均为狂犬病灭活疫苗，质量上也在不断的改进。Pasteur在疫苗研制领域的先锋作用和卓越贡献引起了第一次疫苗革命。到19世纪末，人类在疫苗学领域里已经取得了辉煌的成就，包括2个人用病毒减毒活疫苗（琴纳的牛痘疫苗，巴斯德的狂犬病疫苗），3个人用细菌灭活疫苗（美国Salmon和Smith、法国Chamberlai和Roux的伤寒、霍乱和鼠疫），以及疫苗学的一些基础概念，如Metchnikoff(梅契尼科夫)的细胞免疫(1884年),Ehrlich的受体理论（1897年）及毒素-抗毒素作用。进入20世纪前30年，疫苗学在三个方面取得了重大进展：首先，法国科学家卡默德(LeonCalmette)和介兰(CamileGuerin)在1906年从牛体分离到1株结核菌，经过13年在牛胆汁中传递230代，获得1株减毒株，制成疫苗，于1927年上市，即所谓卡介苗(BCG)。其次，在20年代，巴斯德研究所的Ramon应用化学灭活方法获得白喉和破伤风类毒素并研制成疫苗。第三，WilsonSmith和ThomasFrancis分别在禽胚中研制成功2种灭活甲型流行性感冒（流感）疫苗。20世纪初，法国有两位细菌学家卡默德(LeonCalmette)和介兰(CamileGuerin)，他们共同试制成功了预防结核菌的人工疫苗，又称“卡介苗”。那是秋天的一个下午，卡默德和介兰走在巴黎近郊的马波泰农场的一条小路上做实验，试图把结核杆菌接种到两只公羊身上，但每次都失败了。走着走着，他们发现田里的玉米杆儿很矮，穗儿又小，便关心的问旁边的农场主：“这些玉米是不是缺乏肥料呢？”农场说：“不是，先生。这玉米引种到这里已经十几代了，可能有些退化了。”“什么？请您再说一遍！”农场主笑着说：“是退化了，一代不如一代啦！”看着匆匆离去的两个人，他觉得很好笑。卡默德和介兰从玉米的退化马上联想到：如果把毒性强烈的结核杆菌一代代培养下去，它的毒性是否也会退化呢？用已退化了毒性的结核杆菌再注射到人体中，不就可以既不伤害人体，也能使人体产生免疫力了吗？两位科学家足足花了13年的时间，终于成功培育了第230代被驯服的结核杆菌，作为人工疫苗!有关卡介苗的小故事二次大战后，疫苗研究进入了突飞猛进的发展阶段。波士顿的Enders及其同事发展了病毒的体外细胞培养技术，促进了多种减毒和灭活病毒疫苗的研制。50年代，先有Salk的3价灭活脊髓灰质炎(脊灰)疫苗(IPV)，后有Sabin的3价减毒脊灰疫苗(OPV)，为人类渴望在地球上消灭脊灰提供了有力武器。同一时期还研制了在鸡胚细胞中培养减毒的麻疹疫苗。60年代研制了在鸡胚中减毒的流行性腮腺炎疫苗。70年代研制了在细胞中培养的风疹疫苗。细菌疫苗方面，70年代细菌夹膜多糖的纯化技术促进了多个侵袭性细菌疫苗的研制成功。同一时期的病毒蛋白纯化技术也促进了血源性乙型病毒性肝炎(乙肝)疫苗的研制成功。脊髓灰质炎疫苗历史上最著名的一位脊髓灰质炎病人莫过于富兰克林·罗斯福。1921年的夏天，他在一次游泳之后染上了脊髓灰质炎，最终造成了下肢瘫痪。1938年罗斯福建立了小儿麻痹症全国基金会，用于救治脊髓灰质炎患者，并促进疫苗的研制。在基金会的扶持下，乔纳斯·索尔克(JonasSalk)医生用了近9年的时间，于1953年成功研制出第一个成功的脊髓灰质炎疫苗，这是继天花疫苗、白喉疫苗和流感疫苗后，疫苗研究的又一次重大突破。这种疫苗是一种灭活疫苗（IPV），即把病毒杀死后制备成注射使用的疫苗。索尔克为了证明自己的疫苗是有效且无害的，就在自己和家人身上注射了这种疫苗。最终的结果是皆大欢喜的，索尔克和家人平安无事。20世纪80年代，现代分子技术的应用推动了又一代疫苗的研制，引发了疫苗发展史上的第二次革命，其首要成果是基因重组乙肝疫苗，为人类在地球上消除乙肝提供了希望。与此同时，化学、生物化学、遗传学和免疫学的发展在很大程度上为新疫苗的研制和旧疫苗的改进提供了新技术和新方法（表5-2）。表5-2新技术对疫苗研制和开发的作用及影响学科领域生物技术作用和影响遗传学基因工程和DNA重组（包括基因克隆和表达，DNA测序，DNA合成，核酸内切酶和工具酶，PCR，全基因图谱）抗原鉴定和抗原分离测定抗原的可变性蛋白质抗原的基因工程基