第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础主要内容第一节限制性内切核酸酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶补充：核酶甲基化酶第一节限制性内切核酸酶(RestrictionEndonuclease,RE)一、寄主的限制-修饰系统(R-M,Restriction-modificationsystem)大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修饰作用）修饰的phageλ(K)注：EOP=噬菌体的成斑率第一节限制性内切核酸酶•限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切核酸酶（限制酶）的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。第一节限制性内切核酸酶•限制酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。•1978年，W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖。第一节限制性内切核酸酶•修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶（甲基转移酶）的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制酶的破坏。第一节限制性内切核酸酶第一节限制性内切核酸酶•寄主控制的限制与修饰的作用：一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。•基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受体。例如K12：rk+mk+rk-mk-（用于转化实验）rk-mk+（用于转化实验）rk+mk-（自杀性表型）第一节限制性内切核酸酶•根据限制性内切核酸酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四类。二、限制性内切核酸酶的类型主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源三聚体Mg2+4-6bp回文序列特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割基因工程中广泛使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸REBASE数据库(http：//rebase.neb.com/)第一节限制性内切核酸酶1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。2.若该微生物有不同的变种或品系，再加上该变种或品系的第一个字母，如EcoRⅠ。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，用罗马字母表示，如EcoRⅠ，EcoRⅤ。4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)三、限制性内切核酸酶的命名P14第一节限制性内切核酸酶•若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。EcoRⅠEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号第一节限制性内切核酸酶(一)识别序列的特异性•识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。4bpHpaⅠC↓CGGGGC↑C5bpAvaⅡG↓GWCCCCWG↑G6bpSmaⅠCCC↓GGGGGG↑CCC11bpBg1ⅠGCCNNNN↓NGGCCGGN↑NNNNCCGN=A,T,G,C四、Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性第一节限制性内切核酸酶1.DNA分子酶切片段的末端•Ⅱ型限制性内切核酸酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。(二)切割位点的特异性第一节限制性内切核酸酶（1）5’突出的黏性末端第一节限制性内切核酸酶（2）3’突出的黏性末端第一节限制性内切核酸酶•黏性末端：指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。P16nicknicks.nicknicks,第一节限制性内切核酸酶（3）平末端PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAOHPG-3’3’-GACGTC-5’3’-GPHOACGTC-5’EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCOHPGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGPOHCCC-5’3’-黏性末端5’-黏性末端平末端第一节限制性内切核酸酶第一节限制性内切核酸酶•指来源不同但识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。SstⅠCCGC↓GGSacⅠCCGC↓GGKpnⅠGGTAC↓CAsp718G↓GTACC区分：同切点酶或同裂酶、原型酶、新裂酶2.同切点酶(isoschizomer,同裂酶)P17新裂酶第一节限制性内切核酸酶•指来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同黏性末端的限制性内切核酸酶。P17•一组同尾酶：BamHⅠ(G↓GATCC)、BclⅠ(T↓GATCA)、BglⅡ(A↓GATCT)、Sau3AⅠ(↓GATC)和XhoⅡ(R↓GATCY)•同尾酶产生的DNA片段能通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在分子克隆中很有用。•重组后形成的序列一般不能被原来的任何一种同尾酶所识别。3.同尾酶(isocaudamer)第一节限制性内切核酸酶•1U核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温1h，使1μgDNA完全降解所需的酶量。•大部分Ⅱ型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-150mmol/LDTT(二硫苏糖醇)1mmol/LVolume20-100μLTemperature37℃Time1-1.5h五、Ⅱ型限制性内切核酸酶的反应条件0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Buffer第一节限制性内切核酸酶•在灭菌的0.5mL离心管中进行限制性酶切反应：20μL体积反应体系，加样如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μL限制性内切酶1-2U（单位）加ddH2O至20μL•多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化；或者先一种酶切，然后更换缓冲液，另一种酶再切；又或者使用适合所有限制酶的通用缓冲液。双酶切反应通用缓冲液使用表第一节限制性内切核酸酶•酶切反应的终止EDTA(终浓度10mmol/L)或SDS[终浓度0.1%(W/V)]；65℃温育20min；酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。•酶解结果鉴定琼脂糖电泳•限制酶与识别序列的结合模式GAATTCCTTAAG第一节限制性内切核酸酶•完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。•局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。•通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。酶切的注意事项：浓缩的限制酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释。购买的限制酶多保存于50%甘油中，在-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。注意星号酶切活力。第一节限制性内切核酸酶第一节限制性内切核酸酶(一)酶的纯度(二)DNA样品的纯度•DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性。•可采用以下方法提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间添加阳离子亚精胺六、影响限制性内切核酸酶活性的因素第一节限制性内切核酸酶(三)DNA样品的甲基化程度•E.coli中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclⅠ、MboⅠ等，但BamHⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ不受影响。•E.coli中的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRⅡ等，但BglⅠ、KpnⅠ不受影响。•采用去甲基化酶或甲基化酶缺失的E.coli菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。第一节限制性内切核酸酶(四)酶切反应的温度与时间•大多数限制酶最适反应温度是37℃•酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时，可通过延长酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。(五)DNA的分子构型•某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。酶最适温度℃酶最适温度℃酶最适温度℃ApaⅠBclⅠMaeⅡTaqⅠ30505065ApyⅠBstEⅡMaeⅢ306055BanⅠMaeⅠSmaⅠ504525第一节限制性内切核酸酶(六)限制酶的反应缓冲液•大多数限制酶所需的pH为7.0-7.6。•商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。(七)酶的星号活性(staractivity)•限制酶的识别和切割特异性是在特定的条件下测定的，当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。P19例如当EcoRⅠ在pH8、盐离子浓度50mmol/L和甘油浓度5%时，其识别序列由5’G↓AATTC3’变成5’N↓AATTN3’，特异性明显降低，以EcoRⅠ*表示这种活性。第一节限制性内切核酸酶•导致星号活性发生的因素高甘油含量(5%，V/V)；限制酶用量过大(100U/μgDNA)；低离子强度(25mmol/L)；高pH(pH8.0)；含有机溶剂(如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等)；Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在。•不同的限制酶出现的星号活性的阈值也不一样，常易发生星号活性的酶有：EcoRⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、PstⅠ、ScaⅠ、SalⅠ、HinfⅠ等。第一节限制性内切核酸酶•抑制星号活性的方法尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度；尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染；将离子浓度提高到100-150mM(若酶活性不受离子强度影响)；将反应缓冲液的pH值降到7.0；二价离子用Mg2+。第一节限制性内切核酸酶•重组DNA前的切割•构建新质粒•构建物理图谱•DNA分子杂交•用限制性内切酶消化受体DNA•制备DNA探针•亚克隆以用作序列分析•基因定位，DNA同源性研究七、限制性内切核酸酶的应用第二节DNA连接酶(DNALigase)剪刀—限制性内切酶针线、胶水—连接酶第二节DNA连接酶DNA连接酶第二节DNA连接酶•DNA连接酶是一种能够催化双链DNA上彼此相邻的3’-羟基(-OH)和5’-磷酸基团(-P)，在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。E.coli和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。一、DNA连接酶的发现第二节DNA连接酶•是由T4噬菌体基因30编码的多肽单体；•催化过程需要ATP供能；•可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA的黏性末端或平末端。•抑制剂：PO43-5mM，NaCl25mM，Ca2+0.1mM二、DNA连接酶的特点1.T4DNA连接酶P21第二节DNA连接酶•是由E.coli基因lig编码的一条多肽链；•可被胰蛋白酶水解；•催化过程需要NAD+供能；•能连接具黏性末端的DNA分子，也能连接双链DNA