第二章基因工程载体和工具酶

第二章基因工程载体和工具酶湖南师范大学生命科学学院袁婺洲本章目录2.1载体2.1.1质粒载体2.1.2噬菌体载体2.1.3其他载体2.2工具酶2.2.1限制性核酸内切酶2.2.2DNA聚合酶和Klenow大片段2.2.3DNA连接酶2.2.4碱性磷酸酶2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶第二章基因工程载体和工具酶第一节载体载体的功能及特征运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件克隆载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的装载能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点1.质粒plasmid细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双链DNA大小：1-200kb能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系复制分松弛型和严谨型两种松弛型：10-200拷贝（加氯霉素扩增）严谨型：1-10拷贝有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的天然质粒PcopcopP/OrepreporiCopRep1.质粒的自主复制性：ColE1、pMB1、pSC101等不同启动子pMB1质粒DNA复制启动控制松弛型质粒启动子的突变质粒的基本特征2.质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。质粒的基本特征以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基因2)四环素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因质粒的基本特征3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基因2)四环素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因LacZ基因的显色原理：ClBrClBrONNLacZ基因表达的蓝白斑菌落基因工程质粒：PlasmidpBR322松驰型质粒Ampr，Tetr多种限制性酶切位点全长4362bpPlasmidpBR322结构图4363bppBR322质粒结构来源Plasmidplink322在pBR322基础上改建，增加了一个多接头（polylinker），即增加了多克隆位点。全长3.8kbPlasmidplink322pUC质粒(UniversityofCalifornia)pUC质粒是由大肠杆菌pBR322质粒与M13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体pUC18/pUC19全长2674bp，有Amp抗性基因，一个复制起点ori。带有lacZ的N端标记序列；因在复制起点ori区域内缺失rop基因（改进的pMB1复制子），细胞即使生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700）。宿主菌携带β－半乳糖苷酶C端序列。重组子菌落是白色，空转化子是蓝色。PlasmidpUC18/pUC19结构改建质粒的要求：尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段；增加多种酶切位点；增加标记基因；提高外源DNA的表达水平；增加质粒在受体细胞中的拷贝数转化子的筛选方法遗传标记筛选（载体与目的基因本身）DNA片段大小检测核酸分子杂交目的基因表达产物检测pBR322质粒克隆外源基因的过程载体遗传标记检测抗药性筛选法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs载体遗传标记检测显色筛选法pUC18AprlacZ'oriApr+X-gal重组子（Apr+lacZ-）将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落DNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段：重组子：2.7kb+4.0kb非重组子：2.7kbDNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBP4.0kb1.0kb0.8kb用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子：3.0kb+3.7kb或者：1.0kb+5.7kb用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kb质粒DNA提取的策略质粒DNA的提取细菌细胞破碎----碱使染色体DNA变性-----离心分离------收集质粒DNA-----纯化------保存真核细胞DNA的提取研磨使细胞破碎-----蛋白酶K去核蛋白----分离蛋白质与DNA------纯化-----沉淀------纯度检测质粒DNA的纯化RNA酶去RNASDS-蛋白复合物蛋白酶K去蛋白质酚-氯仿抽提纯化试剂盒紫外分光光度计测A260与A280值：1·8或2·0质粒DNA沉淀二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。乙醇沉淀时，加NaAcorNaCl至终浓度为0·1-0·25M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。0·6倍体积的异丙醇沉淀，-20°C半小时。DNA分离琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳氯化铯密度梯度离心DNA浓度检测琼脂糖凝胶电泳0.05-0.1µgEB-标准DNA浓度比较:1ng紫外分光光度计测A260:0.1-1ideal,0.05-1.5accepted纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。纯DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。EB与DNADNA大小测量凝胶上与标准分子量比较λHindIII100bpladder自己的marker在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？DNA浓度DNA大小波长纯度EB量等有关DNA电泳结果分析2.λ噬菌体λ噬菌体DNA是线性双链DNA分子，48.5kb噬菌体λ粒子，DNA线性双链，带有12bp的粘性末端，称为cos位点。噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状Λ基因组三个区域：左侧：包括外壳蛋白基因，20kb中间区：18kb右侧：复制及裂解基因，12kbλDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源片段5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNAλ噬菌体的基因组结构λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增加酶位点λ-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记λ-DNA载体的构建：加装选择标记lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑(一)插入型载体在Charon4载体中克隆外源DNA3.M13单链噬菌体M13噬菌体的生物学特性：生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成M13DNA全长6407个核苷酸M13DNA上至少有10个基因2700个外壳蛋白分子M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ‘polylinkerDNA测序片段的扩增4.柯斯质粒cosmid1978年由Collins和Hohn改建正常的质粒与噬菌体的cos位点构成有Amp，Tet抗性基因Cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装柯斯质粒（cosmid）的结构pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb柯斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞柯斯质粒的克隆过程5.人工微小染色体YAC,yeastartificialchromosomeBAC,bacteriaartificialchromosomePAC,P1artificialchromosomeMAC,mammalcellartificialchromosomeFosmid,F因子改建而来酵母人工染色体（YAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的中心粒序列酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400kbYAC的构建酵母人工染色体的应用克隆载体的发展历史：第一代：环状质粒，装载几个到十几个kb片段;第二代：经过改建的病毒，装载能力２０kb左右;第三代：cosmid,装载能力30-40kb;第四代:YAC,装载能力1-2Mb;第五代:新型载体:BAC,PAC,MAC,Fosmid等,装载能力80-200kb6.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体7.表达载体表达载体是将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体.表达载体三个系统:1.DNA复制及质粒DNA的筛选:有DNA复制起点ori,及Amp,Tet抗性基因2.目的基因的转录:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.3.蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子.pQE30载体属于PDS质粒家族大肠杆菌T5启动子和转录终止信号表达的蛋白带有一个六聚组氨酸接头GEX-4T-1原核表达载体：具有可高效诱导表达的tac启动子；采用温和洗脱条件可将融合蛋白从亲和介质中洗脱下来，最大限度减少对蛋白活性的影响；具有专一性的凝血酶识别位点，可从融合产物中得到纯化的目标蛋白含有氨苄青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表达质粒吉欧霉素第二章基因工程载体和工具酶第二节工具酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶碱性磷酸酯酶末端转移酶1.限制性核酸内切酶识别双链DNA分子中的特定序