超临界流体色谱对异黄酮的分离

药物与生物医学分析杂志107（2015）364-369题目：超临界流体色谱对异黄酮的分离作者：MarkusGanzera，奥地利因斯布鲁克大学，药学、生药学研究所文献信息：收到来稿2014-10-30收到修订稿2014-12-23审核通过2015-1-6网上发布2015-1-14关键词：异黄酮、超临界流体色谱、手性、葛根、大豆摘要：第一份关于运用超临界液相色谱分析异黄酮的协议报道，在UPC2液相色谱仪的1.7m柱的条件下取得最佳结果，使用溶剂梯度的超临界二氧化碳和甲醇（以磷酸为添加剂）作为洗脱液进行洗脱。这种方法方法在八分钟内使九种异黄酮基线分离（多聚糖和苷类），也适用于膳食补充剂中大豆含量的测定（甘氨酸含量最多），红色格洛弗（三叶草）和葛根（野葛）。分析方法验证这个试验是具有要求的：线性（R2≥0.9994）、准确（回收率97.6~102.4%），以及精确的短期和长期水平（内精密度≤2.1%），并显示萨农柱的检测限为0.2ng以下。这连同其在实际样品分析上优秀的表现表明，超临界流体色谱适用于异黄酮复杂基体中快速、准确的测定。与既定的方法相比较，没有发现什么缺点。因此，超临界流体色谱至少应被视为在这种情况下的一个等效分析替代方法。1．介绍：异黄酮是一种非常小，但在结构和药理性质上都很特殊的一种天然化合物。与普通黄酮类物质相反，它们有三苯基四氢结构，其中苯基部分是位于苯并吡喃环上的C-3而不是通常的取代的C-2（图1）。这种结构结构的改变源于一种类似于激素的机制（它们被分配到植物雌激素组），这说明它们的使用可以治疗或减少更年期和更年期后的的一些症状，比如阵发性皮肤炽热[1]、骨质疏松[2]或者情绪波动[3]。食用含异黄酮丰富的食物（如大豆）甚至可以普遍降低一些亚洲地区的乳腺癌的发生率[4]，也可抑制阿兹海默症的进一步恶化[5]。从文献数据资料来看，是不可能完全确信这些指标的，因为许多药理研究没有观察到这种影响[6,7]。异黄酮主要在豆科植物族中被发现的，与医疗相关的例子是红车轴草（三叶草），葛根（野葛）或大豆（甘氨酸含量最多）。许多分析技术已成功地用于不同基本物质的异黄酮的分离（如植物原料，保健产品，血浆、尿液），包括薄层色谱法[8]，气相色谱[9]，毛细管电泳（CE）[10]。高效液相色谱法在之前从来没有被评测过，而是超临界流体色谱（SFC）这种技术，由于许多理想的特性（见3节）而日益成为受欢迎的常规分析方法。在这种方法中，以一种超临界流体作为流动相进行高效液相色谱的分离，这是一种常用方法。这需与SFE技术（超临界流体萃取）区分开来，其中超临界流体，主要是二氧化碳，用于提取目标物质。后者已被描述为从大豆中的总异黄酮的富集[14]和其他基本物质[15]，但个别异黄酮的分析，还从未尝试过用超临界流体色谱法进行。2．材料和方法：2.1.样品、标准及试剂：样品if2014-1到if2014-6，包括胶囊或片剂（膳食补充剂），含有大豆、红三叶草、葛根提取物或相应的植物原料，在2014年可从因斯布鲁克奥地利药店或在互联网上买到。来自phytolab（德国菲尔特）的以下标准化合物：鹰嘴豆素（A（1）、芒柄花素（2）、染料木素（3）、大豆黄素（4）、大豆苷（5）、染料木苷（6）、大豆异黄酮（7）、大豆苷（8）和葛根素（9）；图1），拥有98.3%或更高的纯度。超临界流体色谱法中用4.5级二氧化碳（纯度99.995%≥；梅塞尔，贡波尔茨基兴、奥地利）和磷酸甲醇为流动相。后边两者都是分析纯级别，从默克公司（德国，达姆施塔特）购买。化合物R1R2R3R4R5鹰嘴豆芽素(1)HOHHOHOCH3刺芒柄花素(2)HOHHHOCH3金雀异黄素(3)HOHHOHOH黄豆黄素(4)HOHOCH3HOH大豆苷元(5)HOHHHOH染料木苷(6)Hß-D-glcHOHOH黄豆黄甙(7)Hß-D-glcOCH3HOH大豆苷(8)Hß-D-glcHHOH葛根素(9)ß-D-glcOHHHOH图1.异黄酮的化学结构的研究2.2、样品制备：取出一粒胶囊的内容物或取一片药片在砂浆细磨平板上，取15毫升甲醇/水混合液（8/2，v/v）在室温下与之超声混合10分钟。然后，样品离心（3000转，10分钟）和超级上清液倒入50毫升容量瓶。这个过程需再重复2倍的时间，最终提取溶剂添加到瓶身刻度线。提取的协议是相同的一个已经验证，并发表的，确保从植物材料中提取的异黄酮的详尽的[16]。由于高含量的大豆异黄酮（if2014-1和个人两样本if2014-5）被进一步稀释的比例1:1。分析前的样品膜过滤（MinisartSRP15、0.2米，PTFE膜；哥廷根，德国）。提取的方法就是上述的一个已经验证，并发表的方法，此法可确保从植物材料中提取的异黄酮的[16]纯度。由于两个独立样品（if2014-1和if2014-5）中的大豆异黄酮的含量较高，所以需要进一步按照1:1的比例稀释。分析前，样品需要经过膜过滤（MinisartSRP15、0.2米，PTFE膜；萨特里厄斯，哥廷根，德国）来确保纯度。通过分析各自的解决方案得出这结论：如果存放在4◦C环境下，样品溶液至少在1个月内是稳定的。2.3、分析条件所有实验用仪器均为Waters（Milford，MA，USA）ACQUITYUPC2SFC，配置有收敛、样品、溶剂和色谱柱的处理系统，以及PDA检测器。操作软件授权3，公布2（水）。采用ACQUITYUPC2色谱柱，柱长1.7米时得到最佳的结果（3毫米100毫米；水），用一系列浓度梯度的二氧化碳（A）和0.05%磷酸在甲醇中的气孔溶胶（B）。在98A/2B条件下洗脱开始，10min后改为75A/25B；75A/25B条件下洗脱液冲柱5min，平衡5分钟。在分析与平衡的过程中流速为2毫升/分钟，柱温调整为50◦C，自动背压调节器（ABPR）将压力调为150帕，注入的样品体积和检测波长分别为1升和254纳米。2.4、方法验证为了准确绘出每一个标准化合物的校准曲线，准确称量样品2.5毫克，放置在一个5毫升的体积瓶内。为方便试验，加入几滴二甲基亚砜与甲醇/水来补充异黄酮溶解量（8/2，v/v）。甲醇与水按照1：2的比例混合，检测限（LOD）和定量限（LOD）经过可视化测量，1~9号峰对应浓度有着3~10倍于基线高度所对应浓度，这样即为有效试验。进一步在操作软件的方法允许的选择范围内且校正水平均备有相同的峰纯度的情况下，连续稀释。精度和精度的测量，也遵循这一原则。因此，三份相同样品（if2014-2）分别加入三个浓度水平的标准已知量。然后，进行了提取和测定。通过比较理论上目前的数额与实际测得的精度进行总结，短期（可重复性）和长期（日间）的精度得到了确认：至于后边if2014-2的独立样本，我们准备了几个连续三天的凹槽，并且在优化的条件下分析。结果在一天到几天内的方差是用来作为中间精度的指标。3、理论：每当物质保持高于其临界温度和压力时，可以得到超临界流体。在这种状态下的液体和气体的功能相结合，例如超临界流体表现出较高的扩散率，但粘度低。根据色谱来说，这是由于较低的压力降低，即使是在高流速下，更快的分离，以及更高的溶解能力和效率[17]下也是这样。所有这些特点都是有利的，因此超临界流体通常被认为是理想的流动相。二氧化碳是几乎完全运用于超临界流体色谱，因为其临界值（31◦C和78帕）是很容易达到的，它是惰性的，不易燃的、廉价的、并且被认为是环保（绿色）。超临界二氧化碳具有类似于正己烷的极性，但通过添加极性改变剂（短链醇、酸、碱等），其溶剂极性强度可以调节，从而可以得到不同极性的化合物，得到正常或反相固定相（18）。在改变超临界流体色谱的分离条件时，必须考虑到这些改变带来的一些意外的作用。例如，较高比例的改性剂带来的效果不仅是升高的临界压力和温度，它也会改变固定相本身的极性[19]。这是由于不等量的改性剂会吸收它，超临界流体色谱的第一个应用程序已经在上世纪60年代末公布，但有着巨大的潜力的它经历了多年的理论研究和技术完善，才达到目前的状态，并增加了具有实际意义的分离技术。4.结果和讨论：这种进一步改进的超临界流体色谱法，对于九种基本化合物是有效可行的。化合物主要有大豆异黄酮（化合物3–8），红色格洛弗花（1，2）和葛根（8，9），如图1所示。这些化合物基础结构基本相同，都属于典型的异黄酮，不同的只是他们的取代基。该结果证明被测物质是含有不同极性分析物的混合物（非极性基，中等极性苷），但同时高效液相色谱被再次证明是完全适合于它们的分离的。图2A中的最佳结果，表明所有九个标准化合物都可以在8分钟内得到很好的处理，第一次采用苷元洗脱接下来是采用苷类来洗脱；因此，得到的洗脱曲线如预期一样，为正相色谱。在方法开发过程中，我们对所有相关方法的参数进行了评估和优化，如图2图2.不同参数对化合物1–9超临界流体色谱分离的影响：优化条件（一），流动相无酸（B），柱温60◦C（C），不同的固定相（ACQUITYUPC2HSSc18sb1.8米；D）。峰分配参考图1。B显示的是采用无酸流动相的结果，所有其他条件均设为最佳。在此情况下，峰形衰退明显，尤其是6–9号苷。采用另一种有机改性剂取代甲醇（乙醇、异丙醇或乙腈）没有解决问题。之所以在0.05%磷酸中加入甲醇是有以下两点原因：首先，更强的酸带来较之之前更好对比性的峰；第二，这种添加剂造成的基线漂移与乙酸或甲酸相比更为细微。此种情况下，柱温和所选背压的影响就很弱了。例如，在60◦C进行分离（图2C）是有利的，因为3和4之间的峰值分辨率低一点，只要ABPR泵压足够高即使在低柱温下也可以使用，从而可进行分离,甚至可能已经达到临界条件。总之，最终选择50◦C因为优化结果对于分析时间和峰的对称性。最后，同样很重要的是最佳的固定相的选择，我们从水域四ACQUITY阶段进行评估，所有的色谱柱具有相同的尺寸（3毫米×100毫米）。除了最后一个，他们都是一个UPC2BEH-2EP1.7米柱，一个为UPC2CSH氟苯基1.7米柱和一个UPC2HSSC18SB1.8米柱。如图2D显示，所得到的是一个极性和非封端的材料。同样，糖苷类化合物的分离以及化合物7的分离是最有问题的：9号化合物不能再分解。除了4和5其他的整体洗脱顺序保持不变，即使使用C18。现在它变得清晰，所以最后选定的色谱柱（ACQUITYUPC2BEH1.7m）和之前提到的条件下可以实现九种异黄酮最佳的超临界流体色谱分离。我们对改进后的超临界流体色谱法进行了验证，发现在大豆异黄酮的第一校准曲线的建立中，其具有良好的线性相关性（R2≥0.9994），浓度与峰面积之间的测试范围（392–2.37克/毫升；表1）的所有标准。该方法的检测限被发现是从0.03（1）0.21克/毫升（7），与后来洗脱苷始终表示较高的值。这可让过这些化合物在254nm，和一个稍宽峰形状的赫内尔-同盟下反应进行说明。然而，考虑到只有1微升样品的实际喷射出的观察灵敏度高，因为它对应于0.03-0.21纳克柱上。其他确认验证参数是选择性，准确度和精度。这可以通过这些化合物在254nm，和一个峰形状稍宽大致较低反应进行说明。然而，考虑到只有1微升样品，实际喷射出的观察灵敏度高，因为它对应于柱上0.03-0.21ng。其他确认验证参数是选择性，准确度和精度。第一个被保证的事实，这是对称的峰没有可见的肩膀和没有迹象的共洗脱记录从200到450纳米（峰纯度）的紫外光谱。在2个浓度水平（表三）的回收实验测定方法的准确性。作为一个加标样品被用作起始原料，这些结果也反映了完整的提取步骤。因此，回收率从97.6%（6，低尖峰）到102.4%（1，低尖峰）证明了提取协议是详尽的，该分析方法是准确的。中间精密度，这是通过重复提取和分析的相同的样品在几天的部分，显示结果为典型的膳食补充剂。由于其部分非均匀性的最大偏差为5%（5，日间，3天）是可以接受的。第一个是通过两个事实确认的，它是没有肩峰的对称的峰，从200到450nm的紫外光谱（峰纯度）没有测到明显的迹象。方法的精度是通过三个